ICS 11.220 CCS B 41 13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5584—2022 兔须癣毛癣菌诊断与防治技术规程 2022 - 05 - 31 发布 2022 - 07 - 01 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 5584—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由河北省农业农村厅提出。 本文件起草单位：河北工程大学。 本标准主要起草人：柳焕章、刘建钗、于国杰、刘利强、刘会洽、杜鹃、刘彦威、刘娜、崔国 林、刘艳莉、吴志勇、崔玉革、李晶晶、娄路平、李夫宏、刘孟啸、赵梓筱。 I DB 13/T 5584—2022 兔须癣毛癣菌诊断与防治技术规程 1 范围 本文件规定了兔须癣毛癣菌病的临床诊断、实验室诊断和综合判定。 本文件适用于兔类、牛、羊、犬、猫等须癣毛癣菌病的诊断及其须癣毛癣菌病原的检测和防治。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB51/T 1419-2012 大熊猫须癣毛癣菌病检验技术规范 3 术语和定义 须癣毛癣菌 Trichophyton mentagrophytes 为人畜共患的皮肤真菌。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PDA：马铃薯葡萄糖琼脂培养基； TSA：胰蛋白胨大豆琼脂培养基； YEPD：酵母浸出粉胨葡萄糖培养基； DMSO：二甲基亚砜； 5 临床诊断 当兔出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据。 临床症状 感染的兔皮肤出现瘙痒、脱毛和皮肤炎症，以头部、四肢部位最多。各种年龄的兔均可感染。 病理变化 病变部位因脱毛而露出粉红色的皮肤并发炎，有的出现结痂，有的结痂下面出现化脓性炎症。 6 实验室诊断 包括常规检测和定量PCR检测技术。 常规检测 6.1.1 样品采集 将患皮癣病的兔，用75%酒精对患处消毒，取无菌手术刀刮取患处及边缘的皮屑、痂皮和被毛等 病料，放入无菌的离心管中于冷藏保存。 6.1.2 病原菌的分离纯化与形态观察 把采集的病料接种到沙氏培养基（含0.5 mg/mL氯霉素）平板，放入27℃真菌培养箱培养10 d， 观察菌落生长情况菌落特征，并涂片镜检，确定纯化后保存备用。 对照兔须癣毛癣菌菌典型菌落形态和菌体形态特征进行初步鉴别（参见附录A ）。 1 DB 13/T 5584—2022 6.1.3 病料显微镜检查（改良的 KOH 法） 取少量病料（皮屑、被毛等），放在清洗干净的载波片上，滴加改良复方KOH溶液（KOH 15 g加 入30 mL蒸馏水中溶解后，依次加入DMSO 40 mL，甘油20 mL，摇匀后加入蒸馏水至1000 mL混匀）1～ 2滴，加盖玻片，用滤纸吸净周边溢液，在显微镜下镜检。 结果判断：将同种病料连续重复两次检查，以病料中查到特征性菌丝和孢子为阳性结果，以检 查不到菌丝和孢子为阴性。 定量 PCR 检测 6.2.1 样品采集 从发病的兔场选择有典型皮肤真菌病的家兔，在病变与健康皮肤组织交界处，用无菌手术刀片 刮取皮屑，放入灭菌的平皿中冷藏保存。 6.2.2 基因组 DNA 提取 使用真菌DNA提取试剂盒提取。 6.2.3 引物合成 参照GenBank中兔须癣毛癣菌benAfum基因转录间隔区序列（KP099602），使用Primer Express 6.0软件设计特异性引物（预期扩增片段大小140bp）： 上游引物F：（5'-GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'） 下游引物R：(5'-GGAGACCATCTGTGAGAGTT-3) 6.2.4 定量 PCR 反应体系和反应程序 采用25 μL的反应体系：SYBR Premix Ex Taq（2×）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板 1.0 μL，用双蒸水补足至25 μL。反应程序为：94 ℃预变性60 S；94 ℃ 10 S，60 ℃ 30 S， 72 ℃ 30 S，进行40个循环。反应结束后，作熔解曲线，采用软件自动分析。 6.2.5 结果判断 当待测样品实时荧光定量PCR检测结果有“S”型扩增曲线，Ct值≤36.5，且Tm值介于86.48 ℃～ 86.65 ℃之间时，判定待测样品中含有须癣毛癣菌。未出现扩增曲线和Tm值，则判断样品中不含须癣 毛癣菌。 7 综合判定 结合临床诊断、实验室检测结果，可确诊兔须癣毛癣菌病。 8 综合防治 预防措施 环境病原菌的净化。可采用火焰喷杀或火碱等消毒产品的喷洒，保持兔舍和运动场宽敞，阳光 充足；保持垫料清洁干燥，发现病兔及时隔离或移除。科学饲养管理，提高兔群的免疫力和抗病能 力。 治疗措施 根据药敏试验结果，选择敏感抗真菌药物治疗。对病兔的药物治疗宜采用内服与外敷相结合的 方法。 2 DB 13/T 5584—2022 A A 附 录 A （资料性） 须癣毛癣菌形态学判断 A.1 须癣毛癣菌形态学判断 须癣毛癣菌菌落形态特征为：在PDA培养基上，菌落为白色，中央致密稍凸起，周围较松散，背 面为黄褐色。符合须癣毛癣菌菌丝和孢子的显微形态特征为：在显微镜下可见典型的螺旋菌丝，小 分生孢子较多，呈葡萄状；大分生孢子较少，呈棒状，有分隔。由菌落形态及菌体镜检结果可初步 判断其为须癣毛癣菌。 3