ICS 11.220 CCS B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 3366—2022 牛中华泰勒虫病检测 PCR 法 PCR detection of theileria sinensis in bovine 2022 - 05 - 18 发布 吉林省市场监督管理厅 2022 - 06 - 08 实施 发 布 DB22/T 3366—2022 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本文件起草单位：延边大学、吉林省牧业信息中心、吉林省畜牧总站、长春市中小企业人才创业指 导中心、延边朝鲜族自治州动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。 本文件主要起草人：贾立军、柴方红、王欣睿、王全利、陈健、王海军、梁晚枫、薛书江、陆秀娟、 肖玉海。 I DB22/T 3366—2022 牛中华泰勒虫病检测 PCR 法 1 范围 本文件规定了牛中华泰勒虫病PCR检测方法的试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤、结果判定 和废弃物处理。 本文件适用于牛中华泰勒虫核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 中华泰勒虫病 theileria sinensis 中华泰勒虫(Theileria sinensis)寄生于牛的红细胞和白细胞中，以发热、贫血、黄疸及体表淋巴结 肿大为典型症状的一种蜱传播性血液原虫病。 4 试剂或材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682中一级水的要求。 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.1.8 4.1.9 试剂或材料 血液 DNA 提取试剂盒。 dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。 Taq DNA 聚合酶。 DNA Marker 分子量标准。 50×TAE 缓冲液见附录 A.1。 加样缓冲液见附录 A.2。 10 mg/mL 溴化乙锭见附录 A.3。 1%琼脂凝胶见附录 A.4。 阳性对照见附录 A.5。 1 DB22/T 3366—2022 4.1.10 4.1.11 4.1.12 4.1.13 4.2 阴性对照见附录 A.6。 质粒 DNA 制备见附录 B。 DNA 凝胶回收试剂盒。 质粒 DNA 提取试剂盒。 引物 PCR反应引物序列与浓度见表 1。 表1 引物 5 PCR 反应引物序列与浓度 引物序列 参考序列 P1 5′-CACTGCTATGTTGTCCAAGAGATATT-3′ GenBan P2 5′-AATGCGCCTAAAGATAGTAGAAAAC-3′ （KX375400.1） 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6 PCR 扩增仪，温度范围：4 ℃～100 ℃。 低温高速离心机，12 000 r/min 以上。 高压灭菌器，120 ℃ 以上。 恒温水浴锅，室温～100 ℃。 分析天平，感量 0.1 mg。 水平电泳槽。 电泳仪，电压 1 V～300 V；电流 1 mA～400 mA。 凝胶成像系统。 微量移液器，单道 2 μL、10 μL、20 μL、100 μL 和 200 μL。 样品 6.1 采集 按照 NY/T 541 规定采集牛抗凝全血，编号待处理。 6.2 处理 牛抗凝全血 2000 r/min 离心5 min，取沉淀待检。 7 试验步骤 7.1 模板制备 按血液基因组DNA提取试剂盒(4.1.1)操作说明书或等效方法提取模板DNA。 7.2 7.2.1 2 PCR 反应 反应体系 长度 浓度 bp pmol/μL 887 10 DB22/T 3366—2022 PCR 反应体系见表 2。 表2 PCR 检测反应体系 试剂 体积 10×Ex Taq 缓冲液 2.0 µL 2.5 mmol/L dNTP（4.1.2） 2.0 µL 10 µmol/L P1 1.0 µL 10 µmol/L P2 1.0 µL 5 U/µL Taq 酶（4.1.3） 1.0 µL 25 mg/L DNA 模板 4.0 µL 灭菌双蒸水 9.0 µL 总体积 20 µL 7.2.2 质量控制 在试样 PCR 反应的同时，以无菌双蒸水作为空白对照，并设置阴性对照和阳性对照，各对照 PCR 反应体系中，除模板外其余组分及 PCR 反应条件与 7.2.1 相同。 7.2.3 反应条件 95 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 45 s，53 ℃ 退火 60 s，72 ℃ 延伸 60 s，循环 30 次；72 ℃ 延伸 7 min，4 ℃ 保存。 7.3 电泳 将所有样品、阳性对照、阴性对照和空白对照的PCR产物按编号加入到1%琼脂糖凝胶板的各孔中， 将凝胶的边孔中加入DNA Marker 分子量标准（4.1.4），将凝胶在 150 V 恒定电压下电泳30 min后， 凝胶成像系统观察电泳结果。 8 8.1 结果判定 试验成立条件 空白对照、阴性对照无扩增条带，阳性对照出现 887 bp的特异性条带，试验成立，否则应重新检 测。标准对照和扩增序列见附录 C。 8.2 试验结果判定 若被检样品出现 887 bp 的特异性条带，判为牛中华泰勒虫核酸阳性。若被检样品未出现扩增条带， 判为牛中华泰勒虫核酸阴性。 9 废弃物处理 试验过程中产生的废弃物，按 GB 19489 规定处理。 3 DB22/T 3366—2022 AA 附 录 A （规范性附录） 聚合酶链式反应（PCR）试验常用试剂配制 A.1 0×TAE缓冲液 A.1.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）的配制见表 A.1。 表A.1 A.1.2 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0） 乙二铵四乙酸二钠 18.6 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 定容至100 mL TAE缓冲液（50×）的配制见表 A.2。 表A.2 TAE 缓冲液（50×）配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0） 10 mL 注：加去离子水定容至100 mL，室温保存备用，使用时稀释50×为工作液。 A.2 加样缓冲液 加样缓冲液的配制见表 A.3。 表A.3 A.3 溴酚蓝 10 mg 甘油 2.5 mL 0.5 mol/L pH 6.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液 定容至10 mL 10 mg/mL溴化乙锭 10 mg/mL溴化乙锭的的配制见表A.4。 4 加样缓冲液 DB22/T 3366—2022 表A.4 A.4 10 mg/mL 溴化乙锭 溴化乙锭 0.1 g 水（H2O） 定容至10 mL 1%琼脂糖凝胶 将三角瓶放在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温 冷却到 50 ℃ 左右，加入 10 mg/mL 溴化乙锭 10 μL，摇匀，倒入电泳板上，凝固后，4 ℃ 备用。 1%琼脂糖凝胶的制备见表 A.5。 表A.5 A.5 1%琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖 1 g 1×TAE缓冲液 定容至100 mL 阳性对照 以含有中华泰勒虫 887 bp 目的基因的质粒 DNA 作为标准阳性对照。 A.6 阴性对照 以未感染中华泰勒虫牛血液提取的 DNA 作为标准阴性对照。 5 DB22/T 3366—2022 BB 附 录 B （规范性附录） 质粒 DNA 制备 质粒DNA制备： a) 按血液基因组 DNA 提取试剂盒(4.1.1)操作说明书提取中华泰勒虫感染的牛血液基因组 DNA； b) 应用牛中华泰勒虫 MPSP 基因序列（KX375400.1）引物（4.2），按 PCR 反应（7.2）扩增 887 bp 目的基因片段； c) 应用 DNA 凝胶回收试剂盒（4.1.12）回收 PCR 扩增产物； d) 将 4 µL 的 PCR 产物、1 µL 的 PMD18-T 克隆载体及 5 µL 的 Solution I 于 PCR 管中，充分混匀， 置 16 ℃ 恒温连接 2 h； e) 将 10 µL 连接产物加入 50 µL 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中，冰水浴 30 min，42 ℃ 热刺激 70 s，冰浴冷刺激 2 min，加入 200 µL 无抗性 LB 液体培养基，于 37 ℃振荡培养箱中培养 2 h 后，涂布于含有 Amp 抗性的 LB 固体培养基平板上，37 ℃ 培养 12 h； f) 挑取 LB 固体培养基平板上的单个菌落，加入到含有 Amp 抗性的 LB 液体培养基中扩大培养，按 质粒 DNA 提取试剂盒（4.1.13）操作说明书提取质粒 DNA； g) 将提取的质粒 DNA 进行 PCR 鉴定和双酶切鉴定后，进行测序分析； h) 将鉴定正确的含有 887 bp 目的基因的质粒 DNA 置于 -20 ℃ 保存备用。 6 DB22/T 3366—2022 CC 附 录 C （规范性附录） 标准对照 标准对照见图 C.1。 M:DL 2000 DNA Marker；1:标准阳性对照；2:标准阴性对照。 图C.1 牛中华泰勒虫 PCR 扩增标准阳性、阴性对照 阳性对照序列见图 C.2。 cactgctatgttgtccaagagatattttaacgcactttgcttaggctatttcctcatctt ctcagcccatgcagctgaagaagccaagaaagacggtgataagaaggatgataagaagga aggtgataagaaggacttgactcttgaggtcactgccacatccgccgagaatgttacagt caactccaccaatgccc