(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210758376.3 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 上海交通大 学 地址 200240 上海市闵行区东川路80 0号 (72)发明人 丁显廷　童蕾　陈晓翔　沈易鞍　 杨天奇　 (74)专利代理 机构 上海旭诚知识产权代理有限 公司 312 20 专利代理师 郑立 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/01(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/532(2006.01) (54)发明名称 一种定量分析系统性红斑狼疮免疫细胞与 功能蛋白的方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种定量分析系统性红斑狼 疮免疫细胞与功能蛋白丰度的方法， 包括荧光流 式实验、 用于CyTOF检测的样本收集和预处理、 用 于CyTOF分析的抗体标记和细胞染色、 样本用于 CyTOF检测和数据处理和统计学分析。 本发明首 次对处于不同疾病活动性的aSLE和rSLE进行系 统的PBMC中的免疫细胞亚群的表型和功能进行 描述， 发现了一个可以潜在的作为细胞预后相关 的多参数的综合的生物标志物Tem样的CD8+CD27 +CXCR3‑T细胞、 CD27蛋白和疾病预后功能相关。 权利要求书1页 说明书9页 附图1页 CN 115165829 A 2022.10.11 CN 115165829 A 1.一种定量分析系统性红斑狼疮免疫细胞与功能蛋白丰度的方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： 步骤1、 荧 光流式实验： 基于SLEDAI标准评分， 选择HCs和 给药治疗后SLE的外周血样本， 提取PBMCs， 进行抗体 染色前的bl ocking实验， 在进行抗体染色， 上机后数据处 理； 步骤2、 用于 CyTOF检测的样本收集和预处 理； 步骤3、 用于 CyTOF分析的抗体标记和细胞染色； 步骤4、 样本用于 CyTOF检测 和数据处 理； 步骤5、 统计学分析。 2.如权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述 步骤2中荧 光流式实验 包括以下步骤： 步骤2.1、 设计、 收集和预处 理样本： 所述预处 理样本包括表型分析的样本预处 理与功能分析的样本预处 理； 步骤2.2、 用于 CyTOF分析的抗体标记和细胞染色； 步骤2.3、 样本用于 CyTOF检测 和数据处 理。 3.如权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤2.1中所述样本为HCs、 aSLE和rSLE 的全血样本 。 4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述是基于SLEDAI标准评分进行筛选， 对 aSLE的定义 为SLEDAI>4， 对rSLE的定义 为SLEDAI≤4。 5.如权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤2.2中所述表型分析的样本预处理 在离体4h内直接 完成。 6.如权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤2.2中所述功能分析的样本预处理 在离体10 h内直接完成。 7.如权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述 步骤3具体包括以下步骤： 步骤3.1、 CyTOF的抗体设计； 步骤3.2、 CyTOF抗体标记； 步骤3.3、 样本细胞计数和样本的Pd编码策略； 步骤3.4、 表面 抗体染色； 步骤3.5、 细胞内 蛋白染色步骤； 步骤3.6、 Ir固定步骤。 8.一种利用如权利要求1所述的方法建立的系统性红斑狼疮早期诊断和预后评估标志 物， 其特征在于， 包括CD 8+CD27+CXCR3 ‑T细胞表面和/或CD27蛋白标记抗体。 9.如权利要求1～7任一项所述的方法在系统性红斑狼疮早期诊断与预后评估中的应 用。 10.如权利要求8所述的标志 物在系统性红斑狼疮早期诊断与预后评估中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115165829 A 2一种定量分析系统性红斑狼疮免疫细胞与功能蛋白的方 法及 其应用 技术领域 [0001]本发明属于疾病诊断及预后评级技术领域， 具体涉及一种质谱流式在建立系统性   红斑狼疮早期诊断与预后标志 物中的应用。 背景技术 [0002]SLE是一种经典的慢性自身免疫疾病， 主要发病特征为对细胞核抗原的耐受， 免   疫复合物在组织的沉积以及多器官累及性损伤。 尽管每年 都会有基于临床经验更新对  SLE 的诊断和治疗的指南， SLE仍然有高于正常人五倍的死亡率。 疾病活动性状态下  的炎症反 应会对机体组织造成累积性损伤， 因此及时的有效诊断及临床治疗干预对于  延缓和控制 SLE的病情进 展， 提高患者的生存质量有着不言而喻的重要意 义。 [0003]但是由于SLE发病的症状具有很大的个体间差异， 目前临床上对于该疾病的早期   诊断仍然存在着巨大的挑战。 首先， 发病频率最高的症状是关节炎， 即关节相关的炎  症， 发 病频率为85％， 但是关节炎对于SLE的确诊并不具有特异性。 研究表明目前和  关节炎相关 的疾病有大约200种， 比如痛 风， 纤维肌痛， 类风湿性关节炎等。 其次，  早期患者通常会表现 出很少的临床症状， 并且有很长的潜伏期。 此外， 还有一些SLE  患者发病症状比较罕见， 例 如常见生化指标抗核抗体(antinuclear  antibody,ANA)阴性  的患者。 这些因素共同导致 了临床SLE诊断困难。 值得注意的是， 临床难以确诊的患  者更有可能是亟需治疗的严重性 SLE。 [0004]CyTOF通过结合荧光流式的进样方式和ICP ‑MS的检测方法， 将基于荧光标签的  信 号读出变成基于金属元素原子质量的信号读出， 可以理论上同时检测>40种的蛋白  分子的 表达。 相比于荧光染料， 单峰的原子质量信号不存在光谱信号重叠的干扰， 并  且由于生物 体内几乎不含有镧系金属元素， 背景信号近乎为0， 并且检测范围广  (75～210Da)， 理论上 可以实现100多种蛋白的同时检测， 在用于复杂疾病的免疫系  统解析方面具有独特的优 势。 [0005]因此， 本领域的技术人员致力于开发一种基于CyT OF对未经过治疗的aS LE和治 疗 后病情缓解的aSLE的随访rSLE血液样 本进行细胞表型、 功能和自噬活性的研究，  系统性的 描述SLE不同疾病状态下的免疫系统状态及其特定细胞亚群的自噬活性， 采  用定量分析细 胞亚群间差异性以寻找SLE中和疾病诊断和预后相关的免疫 多参数的标  志物。 发明内容 [0006]有鉴于现有技术的上述缺陷， 本发明所要解决的技术问题是采用一种高通量分析   方法寻找SLE中和疾病诊断和预后相关的免疫 多参数的标志 物。 [0007]为实现上述目的， 本发明提供了一种定量分析系统性红斑狼疮免疫细胞与功能蛋   白的方法及其应用。 [0008]本发明的第一个方面是提供了一种定量分析系统性红斑狼疮免疫细胞与功能蛋说　明　书 1/9 页 3 CN 115165829 A 3