(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210797221.0 (22)申请日 2022.07.06 (71)申请人 华中科技大 学同济医学院附属协和 医院 地址 430000 湖北省武汉市解 放大道127 7 号 (72)发明人 李俊俊　周子杰　姜晓兵　汪珉杰　 姜呈　朱凯　王旋　 (74)专利代理 机构 武汉天领众智专利代理事务 所(普通合伙) 42300 专利代理师 郭成星 (51)Int.Cl. C12N 5/16(2006.01) C12N 15/02(2006.01) A61K 47/69(2017.01)A61K 31/454(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种融合细胞外囊泡类似物的制备方法及 其应用 (57)摘要 本发明公开了一种融合细胞外囊泡类似物 的制备方法及其应用， 所述制备方法包括如下步 骤： S1、 细胞融合： 将单核细胞溶液与神经干细胞 溶液混匀后， 经挤压、 依次通过10μm、 5μm、 1μ m、 200nm孔径的滤膜， 得到融合细胞外囊泡类似 物粗制液； S2、 融合细胞外囊泡类似物的纯化： 将 步骤S1中得到的融合细胞外囊泡类似物粗制液 进行高速离心， 沉淀用PBS缓冲液洗涤后， 重复操 作两次， 即可得到融合细胞外囊泡类似物。 本发 明制得的融合细胞外囊泡类似物具有更强的胶 质瘤趋化性， 当经鼻内给药后， 能绕过血脑屏障， 通过三叉神经与 嗅神经鼻内分支到达脑胶质瘤 处， 然后释放USP14抑制剂， 解除USP14对于脑胶 质瘤的恶性进展促进作用， 从而缓解脑胶质瘤的 生长与扩散 。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115433720 A 2022.12.06 CN 115433720 A 1.一种融合细胞外囊泡类似物的制备 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 细胞融合： 将单核细胞溶液与神经干细胞溶液混匀后， 经挤压、 通过滤膜后， 得到融 合细胞外囊泡类似物粗制液； S2、 融合细胞外囊泡类似物的纯化： 将步骤S1中得到的融合细胞外囊泡类似物粗制液 进行高速 离心， 沉淀用缓冲液洗涤后， 得到融合细胞外囊泡类似物。 2.根据权利要求1所述的融合细胞外囊泡类似物 的制备方法， 其特征在于， 步骤S1中， 所述单核细胞为来源于人单核细胞白血病细胞系THP ‑1细胞； 所述神经干细胞为来源于人 神经干细胞系ReNcel l VM细胞。 3.根据权利要求1所述的融合细胞外囊泡类似物 的制备方法， 其特征在于， 步骤S1中， 所述单核细胞溶液与所述神经干细胞溶液混合的体积比为 1： 1； 其中， 所述单核细胞溶液中 细胞个数为1 ×107个/ml， 所述神经干细胞 溶液中细胞个数为1 ×107个/ml。 4.根据权利要求1所述的融合细胞外囊泡类似物 的制备方法， 其特征在于， 步骤S1中， 经挤压后、 依次通过10 μm、 5 μm、 1 μm、 20 0nm的滤膜。 5.根据权利要求1所述的融合细胞外囊泡类似物 的制备方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所述高速 离心的参数如下： 10 0000～120000g， 2～3h。 6.权利要求1～5任一项所述的融合细胞外囊泡类似物的制备方法制得的融合细胞外 囊泡类似物。 7.一种负载USP14抑制剂的融合细胞外囊泡类似物， 其特征在于， 由权利要求6所述的 融合细胞外囊泡类似物包载US P14抑制剂所制得。 8.权利要求7所述的负载USP14抑制剂的融合细胞外囊泡类似物的制备方法， 其特征在 于， 所述制备方法具体如下： 将融合细胞外囊泡类似物粗制液与USP14抑制剂溶液混合后， 进行超声处理， 超声完成后， 在37℃孵育1h， 即可得到负载USP14抑制剂的融合细胞外囊泡 类似物粗制液， 所述负载USP14抑制剂的融合细胞外囊泡类似物 粗制液经权利要求 1步骤S2 中的纯化 步骤， 即可 得到负载US P14抑制剂的融合细胞外囊泡类似物。 9.根据权利 要求8所述的制备方法， 其特征在于， 所述USP14抑制剂溶液的终浓度为60 μ mol/L， 所述US P14抑制剂为 IU1‑248。 10.权利要求7所述的负载USP14抑制 剂的融合细胞外囊泡类似物在制备治疗脑胶质瘤 药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115433720 A 2一种融合细胞外囊泡类似物的制备方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及 一种融合细胞外囊泡类似物的制备方法 及其应用。 背景技术 [0002]细胞源性微囊泡是细胞在激活、 损伤或调信时经出芽方式释放的一类直径介于 100～1000nm 的膜性囊泡。 细胞源性微囊泡携带母体细胞特征性生物信息分子(如脂质， 蛋 白质， DNA， mRNA， miRNA)， 并可作为细胞间运输载体将这些生物分子传递给其他细胞。 基于 其生物信息 分子传递功能， 近来年越来越多的学者致力于将细胞源性微囊泡改造成药物释 放纳米载体。 与人工合成的纳米载体相比， 细胞源性微囊泡具有多重优势： 1)在药物到达肿 瘤部位前， 细胞源性微囊泡的双层磷脂结构可保护包裹于微囊泡内的药物， 防止药物被降 解或被代谢； 2)细胞源性微囊泡到达肿瘤部位后， 其双层磷脂结构可与肿瘤细胞膜直接融 合， 促进微囊泡内药物的释放； 3)细胞源性微囊泡可透过生理屏障(如血脑屏障)， 并将药物 有效释放于脑组织治疗脑部疾患； 4)研究表明， 未经修饰的细胞源性微囊泡即具有一定的 肿瘤靶向性； 5)细胞源性微囊泡具有 更强的循环稳定性， 可有效延 长药物在体内的半衰期； 6)最重要的是， 多项临床试验结果表明， 自身来源的微囊泡几乎没有免疫原 性和毒性， 而 人 工合成的纳米载体在免疫原性和毒性方面 仍然存在不可回避的安全隐患。 [0003]当前， 越来越多的证据证明USP14在肿瘤发生发展过程中具有重要调节作用， 同时 鉴于USP14活性位点内半胱氨 酸巯基的活泼性， 有很多研究已经将USP14的抑制剂作为抗肿 瘤药物研究的新方向。 但是静脉给药USP14抑制剂， 药物会广泛的分布在体内， 使得药物利 用率不高， 缺少靶向性， 同时， 也没有相关文献报道US P14抑制剂用于脑胶质瘤的防治。 [0004]中国专利文献CN  108619114  A中公开了一种负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡 及其制备方法和应用， 该方案中利用于鼠巨噬细胞系分泌的天然细胞微囊泡包载地塞米 松， 通过抑制促炎信号通路的活化和炎症细胞的浸润达到改善肾脏炎症的目的； 但是存在 着微囊泡产率较低， 靶向性较差等问题。 [0005]有鉴于此， 有必要提供一种融合细胞外囊泡类似物的制备方法来解决上述技术问 题。 发明内容 [0006]本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种融合细胞外囊泡类似物的制备 方法及其应用， 解决现有的天然细胞微囊泡产率较低、 载 药后， 靶向性较差等问题。 [0007]本发明的第一个目的在于提供一种融合细胞外囊泡类似物的制备 方法。 [0008]一种融合细胞外囊泡类似物的制备 方法， 包括如下步骤： [0009]S1、 细胞融合： 将单核细胞溶液与神经干细胞溶液混匀后， 经挤压、 通过滤膜后， 得 到融合细胞外囊泡类似物粗制液； [0010]S2、 融合细胞外囊泡类似物的纯化： 将步骤S1中得到的融合细胞外囊泡类似物粗说　明　书 1/5 页 3 CN 115433720 A 3