(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210785738.8 (22)申请日 2022.07.04 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 叶招明　邵振轩　陈亮　俞小华　 吴岩　滕王锶源　章增杰　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 万尾甜　韩介梅 (51)Int.Cl. A61K 9/52(2006.01) A61K 47/02(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种缓释mRNA的矿物包被微粒材料及其制 备方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种缓释mRNA的矿物包被微 粒材料， 包 括矿物包被的微粒MCM和包被于MCM中 的mRNA， 可用于实时调控巨噬细胞转变为肿瘤杀 伤性巨噬细胞。 其制备方法包 括以下步骤： (1)制 备脂质体： 配制脂质 ‑乙醇溶液和mRNA ‑柠檬酸缓 冲液， 将两者进行微流控装置混合， 得到mRNA脂 质体纳米颗粒； (2)制备MCM： 首先制备改性模拟 体液mSBF； 将羟基磷灰石粉末分散于改性模拟体 液mSBF中， 将所得溶液旋转并冻干， 得到MCM； (3) 吸附:将所述的MCM和mRNA脂质体纳米颗粒分别 溶于PBS缓冲液中， 两份溶液混合搅拌， 得到所述 的缓释mRNA的矿物包被微粒材料。 本发明不但为 研制高效安全的mRNA的矿物包被微粒材料供理 论依据， 还将为肿瘤免疫 治疗提供新策略。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 115227676 A 2022.10.25 CN 115227676 A 1.一种缓释mRNA的矿物包被微粒材料， 其特征在于， 包括矿物包被的微粒MCM和包被于 MCM中的mRNA。 2.如权利要求1所述的缓释mRNA的矿物包被微粒材料的制备方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： (1)制备脂质体： 配制脂质 ‑乙醇溶液和mRNA ‑柠檬酸缓冲液， 将两者进行微流控装置混 合， 得到mRNA脂质体纳米颗粒； 所述的脂质 ‑乙醇溶液为可电离化阳离子脂质DLin ‑MC3‑ DMA、 磷脂酰乙醇胺HS PE‑MPEG2000、 二硬脂酰磷脂酰胆碱D SPC和胆固醇的乙醇溶 液； (2)制备MCM： 将NaCl、 KCl、 MgSO4·7H2O、 MgCl2·6H2O、 NaHCO3、 Hepes、 CaCl2·2H2O、 KH2PO4和NaF溶于超纯水， 得到改性模拟体液mSBF； 将羟基磷灰石粉末分散于所述改性模拟 体液mSBF中， 将所 得悬浊液旋转并冻干， 得到 MCM； (3)吸附:将所述的MCM和mRNA脂质体纳米颗粒分别溶于PBS缓冲液中， 两份溶液混合搅 拌， 得到所述的缓释mRNA的矿物包被微粒 材料。 3.如权利要求2所述的缓释mRNA的矿物包被微粒材料的制备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 所述的脂质 ‑乙醇溶液中， DLin ‑MC3‑DMA、 HSPE ‑MPEG2000、 DSPC和胆固醇的摩尔比为 50:1.5:10:38.5， 脂质 ‑乙醇溶液的浓度为10mg/ml。 4.如权利要求2所述的缓释mRNA的矿物包被微粒材料的制备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 所述的mRNA ‑柠檬酸缓冲液的制备方法为： 使用超纯水配制柠檬酸和柠檬酸钠的混 合溶液， 加入DEPC， 静置30分钟后高压灭菌去除DEPC， 灭菌后使用DEPC水定容， 得到pH＝4的 柠檬酸缓冲液； 使用所述柠檬酸缓冲液将mRNA稀释至所需浓度， 得到mRNA ‑柠檬酸缓冲液； 所述混合溶 液中， 柠檬酸和柠檬酸钠的摩尔比为3 3:17。 5.如权利要求2所述的缓释mRNA的矿物包被微粒材料的制备方法， 其特征在于， 步骤 (1)的微流控装置混合具体为： 分别将脂质 ‑乙醇溶液和mRNA ‑柠檬酸缓冲液通过0.22微米 滤膜过滤； 将脂质 ‑乙醇溶液和mRNA ‑柠檬酸缓冲液分别吸入注射器中， 并排出注射器中的 空气； 将注射器出口和样品导入管连接， 并固定在注射泵上； 根据具体需要来调整注射泵的 流速和混合体积； 运行， 观察流出管流速稳定后， 用收集管收集流出的液体； 其中， 混合的脂 质‑乙醇溶液和mRNA ‑柠檬酸缓冲液体积之比为1： 3 。 6.如权利要求2所述的缓释mRNA的矿物包被微粒材料的制备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， NaCl、 KCl、 MgSO4·7H2O、 MgCl2·6H2O、 NaHCO3、 Hepes、 CaCl2·2H2O、 KH2PO4和NaF的摩 尔比为141:4:0.5:1:4.2:2 0:5:2:1； 羟基磷灰石粉末以1mg/ml的浓度悬浮在改性模拟体液 mSBF中。 7.如权利要求2所述的缓释mRNA的矿物包被微粒材料的制备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 旋转并冻干的操作为： 将所述悬浊液在37℃下旋转5天， 5天后， 用去离子水洗涤3次， 通过40 μm孔细胞 过滤器过滤， 悬浮在15ml蒸馏水中， 冻干 。 8.如权利要求2所述的缓释mRNA的矿物包被微粒材料的制备方法， 其特征在于， 步骤 (3)中， 混合液中mRNA脂质体纳米颗粒与M CM的质量比为1： 5， 在4℃搅拌3 0min‑1h。 9.如权利要求1所述的缓释mRNA的矿物包被微粒材料的应用， 其特征在于， 用于制备诱 导细胞分化的药物， 所述的细胞分化 为： 使巨噬细胞转变为肿瘤杀伤性巨噬细胞。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115227676 A 2一种缓释 mRNA的矿物包被微 粒材料及其制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药材料技术领域。 更具体地， 涉及一种治疗骨肿瘤的一种 缓释 mRNA的矿物包被微粒 材料及其制备 方法与应用。 背景技术 [0002]近几十年来肿瘤仍然是每年对人类健康构成的最大威胁和主要死亡原因之一， 为 患者自身和整个社会带来了沉重负担。 事实上， 被诊断出患有癌症的儿童超过165,000名， 癌症的财务成本估计为每年1.16万亿美元。 [0003]巨噬细胞可塑性强。 除了肿瘤微环境中促进肿瘤生长 的表型外， 巨噬细胞也可以 转变为肿瘤杀伤性巨噬细胞(Tumoricidal  macrophages)， 且具有良好的治疗效果。 相比改 造T细胞， 巨噬细胞能够以更直接的方式杀死肿瘤特异性抗原多余或未知的肿瘤细胞， 从而 使它们有 可能在T细胞疗法不 足的情况下取得成功。 常规的改造方法为活性生物因子IFNγ 刺激， 但是活性生物因子的药物递送策略经常受到体内低生物活性的限制， 这种限制导致 提供超生理剂量的治疗性蛋白质， 进 而导致临床使用中经常出现负面副作用。 [0004]核酸递送是一种有吸引力的治疗方法， 与其他核酸递送方法相比， mRNA的非病毒 递送具有许多吸引人的特征， 这些特征可能结合了主动表达和安全稳定的特征。 具体而言， mRNA递送不需要将核酸转运至细胞核， 因此， 在非有丝分裂细胞群中mRNA依旧可以有效表 达。 此外， mRNA不是通过同源重组或插 入诱变基因的方式表达， 因此， mRNA具有安全稳定性。 [0005]但是mRNA存在不稳定的缺点。 本发明使用矿物包被的微粒(Mineral ‑Coated  Microparticles,MCM)触发局部递送机制， 稳定mRNA， 提高mRNA转染效率， 同时降低试剂相 关的细胞毒性。 此外， 纳米结构的矿物涂层可以隔离和稳定不稳定的生长因子以防止变性， 从而允许持续的蛋白质释放和延长预期生物反应的刺激 。 发明内容 [0006]为了克服现有重组蛋白效价低， 现有mRNA产品不稳定的缺点， 无法根据实验需求 实时调控巨噬细胞转变为肿瘤杀伤性巨噬细胞能力弱等不足， 本发明提供一种新型 的“负 荷mRNA的矿物包被微粒 材料”的抗骨肿瘤材 料。 [0007]本发明所采用的技 术方案如下： [0008]一种缓释mRNA的矿物包被微粒材料， 包括矿物包被的微粒MCM和包被于MCM中的 mRNA。 [0009]一种缓释mRNA的矿物包被微粒 材料的制备 方法， 包括以下步骤： [0010](1)制备脂质体： 配制脂质 ‑乙醇溶液和mRNA ‑柠檬酸缓冲液， 将两者进行微流控装 置混合， 得到mRNA脂质体纳米颗粒； 所述的脂质 ‑乙醇溶液为可电离化阳离子脂质DLin ‑ MC3‑DMA、 磷脂酰乙醇胺HS PE‑MPEG2000、 二硬脂酰磷脂酰胆碱D SPC和胆固醇的乙醇溶 液； [0011](2)制备MCM： 将 NaCl、 KCl、 MgSO4·7H2O、 MgCl2·6H2O、 NaHCO3、 Hepes、 CaCl2·2H2O、 KH2PO4和NaF溶于超纯水， 得到改性模拟体液mSBF； 将羟基磷灰石粉末分散于所述改性模拟说　明　书 1/4 页 3 CN 115227676 A 3