(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210777801.3 (22)申请日 2022.07.04 (71)申请人 深圳市先康达生命科 学有限公司 地址 518106 广东省深圳市福田区福田街 道福山社区彩田路2048号福建大厦B 座1403 (72)发明人 谢海涛　都晓龙　马丽雅　王乃会　 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/867(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 一种SynNotch结构及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种SynNot ch结构及其应用； SynNotch结构包括启动调控蛋白区， 该结构 进行 逻辑调控嵌合抗原受体免疫细胞， 在调控过程 中， 第一靶点结合SynNotch后功能激活， 水解脱 离的启动蛋白启动自分泌hIL ‑15/Ra超激动蛋白 基因、 CAR结构基因及iCas9自杀基因的表达。 该 发明同时解决了传统CAR结构的常时激活导致的 免疫细胞提前耗竭问题、 免疫细胞的增殖浸润问 题、 免疫细胞的过度杀伤及可能发生严重副反应 的问题和肿瘤微环境的改善问题， 极大的提高了 免疫细胞增殖能力、 抗凋亡能力、 对于肿瘤的杀 伤能力及免疫细胞治 疗的安全性。 权利要求书1页 说明书9页 附图12页 CN 115232217 A 2022.10.25 CN 115232217 A 1.一种SynNotch结构， 其特征在于， 所述SynNotch结构包括启动调控蛋白区； 所述 SynNotch结构通过所述启动调控蛋白区分别调控hIL ‑15/Ra超激动蛋白分泌蛋白、 iCas9自 杀基因表达和嵌合 抗原受体表达 。 2.根据权利 要求1所述的SynNotch结构， 其特征在于， 被调控的所述超激动蛋白基因序 列、 iCas9自杀基因序列及嵌合抗原受体基因序列前面分别包含有调控蛋白区， 该调控蛋白 区的核酸序列 与所述启动调控蛋白区的核酸序列相一 致。 3.根据权利要求2所述的SynNotch结构， 其特征在于， 所述启动调控蛋白区中包括有 GAL4‑VP64、 tetR调控蛋白中的一种； 所述调控蛋白区中包含有UAS核酸序列和tTA核酸序 列； 所述启动调控蛋白区的核酸序列与所述调控蛋白区的核酸序列相匹配结合时， 所述 GAL4‑VP64调控蛋白与所述调控蛋白区的核酸序列UAS结合、 或者所述tetR调控蛋白与所述 调控蛋白区的核酸序列tTA结合。 4.一种表达盒， 其特 征在于， 所述表达盒含有权利要求1至 3任一所述的Syn Notch结构。 5.一种载体， 其特征在于， 所述载体含有含权利 要求1至3任一所述的SynNotch结构、 或 者含有权利要求 4所述的表达盒。 6.一种重组微生物， 其特征在于， 所述重组微生物含有权利要求1至3任一所述的 SynNotch结构、 或者含有权利要求 4所述的表达盒、 或者权利要求5所述的载体。 7.一种免疫细胞， 其特征在于， 所述免疫细胞含有权利要求1至3任一所述的SynNotch 结构、 或者权利要求 4所述的表达盒、 或者权利要求5所述的载体。 8.根据权利要求7所述的免疫细胞， 其特征在于， 所述免疫细胞中， SynNotch结构包含 有第一靶点结合区域； 当所述免疫细胞中， SynNotch结构调控嵌合抗原受体时， 该嵌合抗原 受体包含有第二靶点结合区域； 第一靶点结合区域和 第二靶点结合区域分别包含有第一靶 点和第二靶点； 所述第一靶点及第二靶点为IL ‑13Rα2、 CLDN18.2、 GPC3、 HER2、 TAA、 GD2、 MSLN、 EGFR、 NY ‑ESO‑1、 MUC1、 PSMA和EBV中的一种或 几种； 优选， 所述第一靶点及第二靶点分 别为IL‑13Rα 2和CLDN18.2。 9.一种生物制剂， 其特征在于， 所述生物制剂包含有权利要求1至3任一所述的 SynNotch结构、 或者权利要求4所述的表达盒、 或者权利要求5所述的载体、 或者权利要求7 或8所述的免疫细胞。 10.根据权利要求9所述的生物制剂在治疗/预防肿瘤和/或癌症药物方面的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115232217 A 2一种SynNotch结构及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 细胞制备技 术领域， 尤其涉及一种Syn Notch结构及其应用。 背景技术 [0002]肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下， 局部组织细胞增生所形成的新生 物(neogrowth)， 因为这种新生物多呈占位性块状突起， 也称赘生物  (neoplasm)。 其中， 恶 性肿瘤因易发生 转移， 治疗后易复发且在某些 特殊的微环境下导 致极难治愈 。 [0003]IL‑15在T细胞、 NK细胞及其发育、 稳态和功 能中起着至关重要的作用， 并且还对B 细胞、 树突状细胞(DC)、 巨噬细胞和肥大细胞具有各种功能。 IL ‑1 5是细胞因子4 ‑α‑螺旋束 家族的成员， 分子量为14 ‑15kDa， 含有114个氨基酸。  IL‑15具有两种同种类型： ①SSP： 包含 21个氨基酸组成的较短的信号肽(SSP，  short signal peptide)， SSP型IL ‑15被充分翻译 但并不分泌， 因此， 它的活动范围被限制在细胞质和细胞核， 可能在其转录调控中起着 重要 作用；②LSP： 包含48个氨基酸组成的更长的信号肽(LSP， long  signal peptide)， LSP ‑IL‑   15是作为免疫调节剂被分泌至胞外的。 IL ‑15以及IL ‑15Rα 由抗原呈递细胞(单核细胞和树 突细胞)协同表达。 IL ‑15广泛表达于多种细胞中， 细胞类型包括单核细胞、 巨噬细胞、 DC细 胞、 成纤维细胞、 上皮细胞和骨骼肌细胞， 但在T细胞中并不表达I L‑15细胞因子 。 [0004]IL‑15与抗原受体的结合方式为反 式呈递方式： IL ‑15与表达在抗原提呈细胞上高 亲和力的α 受体结合， 形成IL ‑15Rα； IL‑15Rα将IL ‑15递呈给IL ‑2 /15Rβ γ二 聚体形成三元 复合物。 可激活JAK和STAT型号通路， 并具有促进靶细胞增殖与活化、 IFN ‑γ、 TNF‑α 分泌水 平提升等功能。 [0005]传统的Notch信号通路包括Notch受体、 Notch配体、 细胞内效应分子、 D  NA结合蛋 白、 受调控的下游基因等。 Notch受体是跨膜受体， 当胞外域结合到N  otch配体后， 细胞运动 致使s2位点暴露， 被金属蛋白酶等识别切割， 释放胞内段入核， 从而启动下游基因表达。 Wendella.Lim团队改造了鼠的Notch1受体， 将其胞外域用单链抗体或者纳米抗体替换， 胞 内域用转录激活或转录抑制的结构域替换， 仅保留了可以被蛋白酶识别切割的跨膜核心 域， 还配备了下游被调控的基因元件。 针对不同的疾病或者肿瘤抗原， 胞外域采用特异识别 该抗原的抗体单链， 而 胞内域调控预先设定的目标基因或因子的表达。 难得的是， 在同一细 胞中可以设计由不同抗原启动的基因调控环路， 并具有很好的正交性。 Syn Notch系统可以 被应用到许多细胞类型中， 包括神经细胞、 免疫细胞。 CAR ‑T技术和SynNotch系统组合应用 到T细胞改造中， 可以实现T细胞的 “与”门激活， 即只有当细胞同时表达两种特定的表面抗 原时， 才能将T细胞激活。 改变SynN otch下游调控的基因元件， T细胞可以在接触特定抗原 后， 分泌单链抗体、 细胞因子等等具有治疗作用的因子， 并且在体外、 体内都具有抗肿瘤的 作用。 可见SynNotch受体系统， 在 细胞改造中具有极大的技 术优势。 [0006]近几年来， 肿瘤免疫疗法发展迅速， 尤其是过继性细胞疗法(ACT)， 即指从病人体 内分离出T细胞、 NK细胞等免疫细胞， 通过体外修饰扩增培养， 随后回输入患者体内进行肿 瘤治疗的方法。 2013年， 肿瘤的免疫疗法被Science杂质评为 “十大突破 ”之首。说　明　书 1/9 页 3 CN 115232217 A 3