(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210772303.X (22)申请日 2022.06.30 (71)申请人 宁夏医科大学 地址 750000 宁夏回族自治区银川市 兴庆 区胜利街1 160号 (72)发明人 段相国　苏春霞　田金花　刘淼　 杨小娟　马斌　 (74)专利代理 机构 宁夏君创未来专利代理事务 所(普通合伙) 64107 专利代理师 周晓梅 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/867(2006.01) A61K 31/7088(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) (54)发明名称 负载miR-2 06的肿瘤细胞衍生外泌体的制备 方法及应用 (57)摘要 一种负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体的 制备方法包括以下步骤： 步骤S001， 用包含目的 基因miR‑206的慢病毒转染HT29结直肠癌细胞； 步骤S002， 使用嘌呤霉素筛选能够稳定过表达 miR‑206的HT29结直肠癌细胞； 步骤S003， 收集 HT29结直肠癌细胞的上清液， 通过超速离心法获 得负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体。 本发明 的负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体能够有效 地结合结直肠癌细胞所表达的TIGIT分子， 使 TIGIT在结直肠癌细胞中的表达能力降低， 从而 影响结直肠癌细胞的增殖、 迁移、 侵袭和凋亡能 力、 有效的恢复免疫细胞的能力， 从而有效地发 挥其抗结直肠癌的作用。 肿瘤细胞衍生外泌体 miR‑206在基因水平上有效地发挥了抗结直肠癌 能力。 权利要求书1页 说明书4页 附图7页 CN 115074333 A 2022.09.20 CN 115074333 A 1.一种负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备 方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 步骤S001， 用包含目的基因miR ‑206的慢病毒转染HT2 9结直肠癌细胞； 步骤S002， 使用嘌呤霉素筛 选能够稳定过表达miR ‑206的HT29结直肠癌细胞； 步骤S003， 收集HT29结直肠癌细胞的上清液， 通过超速离心法获得负载miR ‑206的肿瘤 细胞衍生外泌体。 2.如权利要求1所述的负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备方法， 其特征在于： 慢病毒转染HT2 9结直肠癌细胞包括以下步骤： 步骤S101， 将HT2 9结直肠癌细胞铺于六孔板中， 等待HT2 9结直肠癌细胞贴壁 生长； 步骤S102， 在六孔板中换用含有病毒LV ‑miR‑206及LV‑NC和转染液HitransG  P的细胞 培养液， 在CO2培 养箱中37℃  的温度下培 养10小时； 步骤S103， 更换细胞培 养液， 继续培 养48h， 荧 光显微镜下观察； 步骤S104， 当细胞培 养液中的细胞量达 到90%及以上时加入嘌呤霉素筛 选出稳定株。 3.一种负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体在制备抗结直肠癌药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074333 A 2负载miR‑206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物医学技术领域， 尤其涉及一种负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌 体的制备 方法及其应用。 背景技术 [0002]结直肠癌 （Colorectal  cancer， CRC） 是 目前备受关注的恶性消化道肿 瘤之一， 其 死亡率逐年升高。 近些年来， 针对肿瘤治疗的外科手术技术和放化疗治疗方案有 所进展， 但 由于放化疗对患者有着极大的副作用， 故探索新型的治疗药物迫在眉睫。 发明内容 [0003]有鉴于此， 有必要提供一种负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备 方法。 [0004]还有必要提供一种负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体的应用。 [0005]一种负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备 方法包括以下步骤： 步骤S001， 用包含目的基因miR ‑206的慢病毒转染HT2 9结直肠癌细胞； 步骤S002， 使用嘌呤霉素筛 选能够稳定过表达miR ‑206的HT29结直肠癌细胞； 步骤S003， 收集HT29结直肠癌细胞的上清 液， 通过超速离心法获得负载miR ‑206的 肿瘤细胞衍生外泌体。 [0006]优选的， 慢病毒转染HT2 9结直肠癌细胞包括以下步骤： 步骤S101， 将HT2 9结直肠癌细胞铺于六孔板中， 等待HT2 9结直肠癌细胞贴壁 生长； 步骤S102， 在六孔板中换用含有病毒LV ‑miR‑206及LV‑NC和转染液HitransG  P的 细胞培养液， 在CO2培 养箱中37℃  的温度下培 养10小时； 步骤S103， 更换细胞培 养液， 继续培 养48h， 荧 光显微镜下观察； 步骤S104， 当细胞培养液中的细胞量达到90%及以上时加入嘌呤霉素筛选出稳定 株。 [0007]一种负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体在制备抗结直肠癌药物中的应用。 [0008]有益效果： 本发明的负载miR ‑206的肿瘤细胞衍生外泌体能够有效地结合结直肠 癌细胞所表达的TIGIT分子， 使TIGIT在结直肠癌细胞中的表达能力降低， 从而影响结直肠 癌细胞的增殖、 迁移、 侵袭和凋亡能力、 有效的恢复免疫细胞的能力， 从而有效地发挥其抗 结直肠癌的作用。 肿瘤细胞衍生外泌体miR ‑206在基因水平上有效地发挥了抗结直肠癌能 力。 附图说明 [0009]图1为转染前后HT2 9细胞中miR20 6的表达对比图。 [0010]图2为外泌体对细胞活力的影响对比图。 [0011]图3和图4 为外泌体对结直肠癌细胞迁移能力的影响对比图。 [0012]图5和图6为外泌体对结直肠癌侵 袭和趋化能力的影响对比图。说　明　书 1/4 页 3 CN 115074333 A 3