(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210633057.X (22)申请日 2022.06.06 (71)申请人 重庆大学附属肿瘤医院 地址 400030 重庆市沙坪坝区汉渝路181号 (72)发明人 向廷秀　喻仁杰　 (74)专利代理 机构 北京元本知识产权代理事务 所(普通合伙) 11308 专利代理师 黎昌莉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 乳腺癌生物标志物ZNF662基因及其检测方 法与应用 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 具体涉及一种乳 腺癌的生物标志物ZNF662基因及其检测方法与 应用。 该生物标志物为ZNF662基因， 待测样本来 源于疑似乳腺癌的患者， 该ZNF662 基因核苷酸为 SEQ ID NO： 1。 本申请提供了以一种检测ZNF662 基因启动子甲基化状态的方法， 具体步骤为： ① 提取DNA样本； ②设计引物， 采用甲基化检测试 剂， 通过MSP方法检测DNA样本中Z NF662基因启动 子的甲基化水平， 判断该Z NF662基因是否发生甲 基化， 从而实现乳腺癌诊断。 本申请通过体内、 体 外实验率先证实ZNF662作为一个全新的抑癌基 因， 其在乳腺癌中由于启动子高甲基化而表达下 调， 为乳腺癌早期诊断标志物的筛选提供了新选 择。 权利要求书1页 说明书11页 序列表3页 附图11页 CN 114921549 A 2022.08.19 CN 114921549 A 1.乳腺癌的生物标志物， 其特征在于， 所述生物标志物为ZNF662基因； 所述待测 样本来 源于疑似乳腺癌的患者； 所述ZNF6 62基因核苷酸 为SEQ ID NO： 1。 2.根据权利要求1所述的生物标志物， 其特征在于， 所述生物标志物为未发生甲基化的 ZNF662基因和/或已发生甲基化的ZNF6 62基因。 3.根据权利 要求1所述的生物标志物， 其特征在于， 所述生物标志物为ZNF662基因的启 动子， 所述启动子的核苷酸 为SEQ ID NO： 2。 4.用于检测权利要求1所述生物标志物的引物， 其特征在于， 所述引物包括3对引物对， 分别为： 具有SEQ  ID NO： 3所示核苷酸的正向引物1， 具有SEQ  ID NO： 4所示核苷酸的反向引 物1； 具有SEQ  ID NO： 5所示核苷酸的正向引物2， 具有SEQ  ID NO： 6所示核苷酸的反向引物 2； 具有SEQ  ID NO： 7所示核苷酸的正向引物3， 具有SEQ  ID NO： 8所示核苷酸的反向引物3 。 5.含有权利要求2所述的引物的试剂， 其特征在于， 所述试剂还包括甲基化检测试剂和 用于提取样本DNA的试剂。 6.用权利 要求4所述引物和/或权利 要求5所述试剂检测ZNF662基因启动 子甲基化状态 的方法， 其特 征在于， 具体包括以下步骤： (1)用权利要求5所述 提取样本DNA的试剂提取DNA样本； (2)利用权利 要求4所述的引物和/或权利 要求5所述的试剂， 通过MSP方法检测所述DNA 样本中ZNF6 62基因启动子的 甲基化水平， 得到其MS P电泳图结果。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 采用MethlTarget测序检测进一步验证权 利要求6得到的MSP结果， 再将结果与正常组的启动子甲基化位点进行对比， 判断其甲基化 状态。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述方法适用于各种体液检测， 所述样本 包括外周血、 粪便、 组织和/或细胞。 9.权利要求1所述的生物标志物、 权利要求4所述的引物和/或权利要求5所述的试剂在 制备用于诊断乳腺癌的试剂盒中的应用。 10.权利要求1所述的ZNF662基因的甲基化抑制剂在制备用于治疗乳腺癌的药物中的 应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921549 A 2乳腺癌生物标志物ZNF6 62基因及其检测方 法与应用 技术领域 [0001]本发明属于生物学技术领域， 具体涉及一种乳腺癌的生物标志物ZNF662基因及其 检测方法与应用。 背景技术 [0002]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一， 发病率一直排行全球女性癌症的第一， 同 时也是全球女性癌症死亡的主要原因之一。 在我国乳腺癌的新发病率占女性新发总恶性肿 瘤的15％。 在 治疗方面， 手术仍是乳腺癌的首选， 与此同时， 非手术治疗逐渐变得成熟起来。 尽管近年来治疗策略取得了重大进展， 但由于乳腺癌是一种异质性极强的疾病， 患者的临 床表现和治疗反应各不相同， 因此乳腺癌患者的临床治疗仍然存在巨大的挑战。 早期发现、 早期诊断和早期治疗 对于改善 乳腺癌患者预后， 提高患者 生活质量具有重要意 义。 [0003]乳腺癌常见早期筛查技术包括： (1)乳腺超声检查： 简单方便， 无创无辐射， 敏感度 和准确度高， 但难以发现微小钙化及毛刺样改变， 不能可靠区分良恶性。 (2)乳腺X线检查： 对于各层次结构能清晰显示， 对钙化灶敏感度高， 但对40岁以下及致密性乳腺诊断准确性 欠佳， 其辐射性也存在争议。 (3)乳 腺MRI检查： 敏感性最高， 对于深 部病灶显示好， 但检查时 间长， 价格昂贵， 有 条件限制使其一般做为上述检查的补充措施。 (4)基因检测： 作为当今基 因组学不断发展的重要成果之一， 其在恶性肿瘤早期筛查的临床应用也越来越受到重视， 然而乳腺癌缺乏特异性的生物标志 物使其受到限制。 [0004]DNA甲基化生物标志物定义为在致癌过程中发生D NA甲基化变化的分子靶标。 这种 生物标志物可用于癌症的早期检测， 预测和/或监测治疗反应以及复发性癌症的检测。 因此 肿瘤特异性DNA甲基化生物标记的发现并检查候选DNA生物标记将其用于临床是目前研发 的重点。 目前研究较广泛和验证较充分的DNA甲基化生物标记物有： 组织因子途径抑制剂2 (TFPI2)， Septin9(SEPT9)， 谷胱甘肽S ‑转移酶pi1(GSTP1)， 和6 ‑甲基鸟嘌呤 ‑DNA甲基转移 酶(MGMT)以及5 ‑羟甲基胞嘧啶。 异常DNA甲基化的发现是用于癌症诊断和治疗的特定标记 的主要候选对象。 近年来， 随着临床检验诊断技术的完善与 发展， 恶性肿瘤中DNA甲基化生 物标志物具体的甲基化位点也越来越受关注。 但总体而言， DNA甲基化标志物在肿瘤中的临 床应用仍需更多的基础研究和临床讨论。 [0005]DNA甲基化贯穿于肿瘤发生发展的整个过程中， 且由于其敏感性、 特异性和易于分 析的特点很有希望成为常规的临床肿瘤标志 物。 [0006]本申请通过基因DNA甲基化检测， 提高样本的检测灵敏度和特异性， 提高早期诊断 率。 且利用本方法进行检测， 方法简单 无创， 易行 方便， 经济实惠， 容 易被大众所接受。 [0007]DNA甲基化检测相较于常规检测手段更有利于早期癌症的发现， 原因如下:(1)表 观遗传的变化， 比如DNA甲基化的改变在肿瘤形成的早期发生， 具有组织和癌种特异 性； (2) DNA甲基化类型贯穿肿瘤组织和同一类型的肿瘤， 但体细胞突变通常只在癌细胞的亚群或 克隆中； (3)DNA甲基化在更大的基因 区域中保持稳定， 因此能通过多个CpG二核苷 酸进行检 测； (4)可同时设计多对引物进 行联合检测； (5)适用于各种体液检测， 可用来补充细胞学检说　明　书 1/11 页 3 CN 114921549 A 3