ICS 11.220 B 41 备案号： 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB42/T 788—2012 猪流感病毒(H1 亚型)酶联免疫吸附试验抗 体检测方法 Method of the Enzyme-linked immunosobent assay for the detection of antibodies against swine influenza virus (subtype H1) 2012 - 01 - 06 发布 湖北省质量技术监督局 2012 - 03 - 01 实施 发 布 DB42/T 788—2012 目  次 前言..................................................................................................................................................................... II 引言................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 缩略词............................................................................................................................................................. 1 3 实验原理......................................................................................................................................................... 1 4 实验条件......................................................................................................................................................... 1 5 实验材料......................................................................................................................................................... 1 6 实验方法......................................................................................................................................................... 2 7 结果判定......................................................................................................................................................... 3 8 注意事项......................................................................................................................................................... 3 附录 A.................................................................................................................................................................... 4 I DB42/T 788—2012 前  言 本标准按 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由湖北省农业厅归口。 本标准起草单位：华中农业大学动物医学院、武汉科前动物生物制品有限责任公司、湖北省动物疫 病预防控制中心。 本标准主要起草人：金梅林、郭学波、杨影、陈焕春、徐高原、钟广汉、宋念华、田峰、董晓辉、 孙小美、李淑云。 II DB42/T 788—2012 引  言 猪流感病毒(Swine Influenza Virus, SIV)属正粘病毒科，可引起猪流行性感冒(Swine Influenza, SI)。 在猪群中广泛流行的 SIV 主要是古典型 H1N1 和类禽型 H1N1，可引起猪咳嗽、呼吸困难、发热和衰竭 等症状易暴发流行。由于 SIV 对呼吸道上皮的高度特异亲嗜性而使呼吸道管壁上皮受损，导致猪链球 菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌等细菌和猪呼吸道冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病 毒等的继发或混合感染，使病情更为复杂。为开展猪流感的免疫监测，了解猪群猪流感病毒抗体水平， 指导猪流感免疫预防工作，特制定本标准。 III DB42/T 788—2012 猪流感病毒(H1 亚型)酶联免疫吸附试验抗体检测方法 1 范围 本标准规定了猪流感病毒(H1 亚型) 酶联免疫吸附试验抗体检测方法的缩略词、实验原理、实验条 件、实验材料、实验方法、结果判定和注意事项等。 本标准适用于猪血清中的流感病毒抗体的检测。 2 缩略词 下列缩略词适用于本文件。 ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）：酶联免疫吸附试验 OD630nm 值：630 纳米波长处的吸光值 HRP：辣根过氧化物酶 HI 法：血凝抑制试验法 S：样品孔 OD630nm 值 P：阳性对照孔 OD630nm 平均值 3 实验原理 应用酶联免疫原理制成检测猪流感病毒（H1 亚型）抗体的间接 ELISA 方法。利用抗原抗体反应的 特异性，将特异性的猪流感病毒（H1 亚型）抗原吸附到固相载体的表面后，待检物中若含有相应的抗 体，则可与所包被的抗原相结合，并能进一步和酶标记抗体结合形成复合物。在遇到相应的底物时，复 合物中的酶能催化底物发生显色反应。其显色的深浅与相应的抗体量成正相关，可借助 OD630nm 值的大 小进行定性判断。 4 实验条件 4.1 实验室 实验操作宜在常温（18 ℃～25 ℃）进行。 4.2 仪器 台式低温高速离心机、微量移液器、冰箱、恒温箱、酶标仪。 4.3 人员 注意个人防护和环境保护。 5 实验材料 1 DB42/T 788—2012 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 猪流感病毒（H1 亚型）抗原（见附录 A.8）。 酶标板：96 孔板，可拆。 酶标记抗体（见附录 A.9）。 阳性对照血清（见附录 A.10）。 阴性对照血清（见附录 A.11）。 其它试剂 包被液、封闭液、洗涤液、样品稀释液、底物液 A、底物液 B、终止液。试剂配方及要求见附录 A。 6 实验方法 6.1 样品采集 将采集的猪全血静置 30 min，收集上清备用。 6.2 抗原包被板制备 取猪流感病毒（H1 亚型）抗原用包被液稀释到工作浓度（2.5 μg/mL），加入酶标板，100 μL/孔， 37 ℃孵育 2 h。弃去孔中液体，拍干。加入封闭液，200 μL/孔，于 37 ℃封闭 2 h，取出酶标板弃去孔中 液体在吸水纸上拍干，于 2 ℃～8 ℃保存，可保存 7 d。 6.3 样品稀释 在血清稀释板中按 1:40 的比例稀释样品（例如：195 μL 样品稀释液中加入 5 μL 样品，即为 1:40 稀释）。稀释好的样品可在 2 ℃～8 ℃保存 7 d。 6.4 加样 取出抗原包被板（根据样品多少，可拆开分次使用），先用洗涤液洗板 1 次，再将稀释好的样品取 加入抗原包被板，100 μL/孔。同时设 2 孔阴性对照、2 孔阳性对照及 1 孔空白对照，轻轻振匀孔中样品 （勿溢出），置 37 ℃下孵育 30 min。 6.5 洗涤 取出抗原包被板弃去孔中液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液洗板 3 次，200 μL/孔。每次静置 3 min 后倒掉液体，在吸水纸上拍干。 6.6 加酶标记抗体 取酶标记抗体用样品稀释液稀释到工作浓度，加入酶标板，100 μL/孔，37 ℃孵育 30 min。按 6.5 中方法洗板 3 次。 6.7 加底物液 每孔加底物液 A 和底物液 B 各 50 μL，混匀，置室温下（18 ℃～25 ℃）避光显色 10 min。 6.8 加终止液 每孔加终止液 50 μL，轻轻振荡混匀。 6.9 2 测定结果 DB42/T 788—2012 以空白对照孔调零，用酶标仪测定各孔的 OD630nm 值。测定结果必须在加入终止液后 10 min 内完成。 7 结果判定 7.1 试验成立的条件是两个阳性对照孔的 OD630nm 值相差应＜0.3；两个阳性对照孔 OD630nm 值均应≥ 0.8，且＜1.6。两个阴性对照孔 OD630nm 值均应＜0.2。 7.2 如果 S≥0.3，判为阳性；如果 S＜0.3，则判为阴性。 8 注意事项 实验过程中注意做好个人的生物安全防护措施，废弃物应做无害化处理。 3 DB42/T 788—2012 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 包被液的配制 碳酸钠（Na2CO3） 1.59 g