ICS 65.020.20 CCS B 34 34 安徽省地方标准 DB34/T 4315 —2022 甜叶菊组培快繁技术规程 Technical regulations for tissue culture an d rapid propagation of Stevia rebaudiana 2022 - 10 - 26 发布 2022 - 11 - 26 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 4315 —2022 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由阜阳师范大学提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：阜阳师范大学、界首市佳祺农业开发有限公司、淮北泽优农业发展有限公司、安 徽田园居电子商务股份有限公司、安徽省功能性果饮生态发酵工程研究中心、中国科学院亚热带农业生态研究所、安徽稷神农业科技有限公司、阜阳市颍州区农业广播电视学校、阜南县公桥乡农业综合服务站、淮北市相山区农业农村水利局、安徽农之源生态农业有限公司。 本文件主要起草人：兰伟、徐高骁、胡新、孔祥峰、纵玉华、胡仲华、刘旭、杜天志、杨光硕、李 瑞龙、陈颖、于涛、徐灵杰、张顺。 DB34/T 4315 —2022 1 甜叶菊组培快繁技术规程 1 范围 本文件规定了甜叶菊[ Stevia rebaudiana （Bertoni） Hemsl.]组培快繁的组培设施、培养基配 制、灭菌、无菌苗初代培养、继代增殖培养、生根培养、炼苗、组培苗清洗和移栽、档案管理。 本文件适用于甜叶菊组培苗工厂化生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 JB/T 10594 日光温室和塑料大棚结构与性能要求 LY/T 2289 林木种苗生产经营档案 NY/T 2306 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 组培设施 洗涤室 4.1.1 应宽敞明亮、通风良好、水电配套、排水畅通。墙面和地面应便于清洁，地面要做防滑处理。 4.1.2 配置洗瓶机、烘箱、小推车等。 准备室 4.2.1 应空间宽敞、清洁明亮、通风良好、墙壁光滑、地面平坦。设有工作台和水池。 4.2.2 配置高压蒸汽灭菌锅、微波炉、托盘、水浴锅、蒸馏水器、冰箱、培养箱、电子分析天平、电 子天平、电热磁搅拌器、酸度计、培养基自动定量灌装机等。 接种室 4.3.1 应干爽安静、清洁明亮，墙壁光滑平整，地面平坦无缝。 4.3.2 配置超净工作台、双筒实体显微镜、空调、紫外灯、空气净化装置、组培灭菌器、镊子、剪刀 等。 培养室 4.4.1 应温度可控，光照强度和光照时间可控，湿度可控，相对密闭。 4.4.2 配置紫外灯、空气净化装置、空调、程控定时器、温度计、湿度计、光照培养箱等。 DB34/T 4315 —2022 2 温室 温室建造按 JB/T 10594 的规定执行。可选择玻璃温室或薄膜温室，温度可控范围 15℃～32℃， 可以喷水补湿，并且具有良好的防虫隔离条件。 5 培养基配制 培养基类型 5.1.1 基本培养基 MS培养基为基本培养基，成分见附录A。 5.1.2 初代培养基 MS＋6-BA（6-苄氨基嘌呤）1.0 mg/L～1.5 mg/L + NAA（萘乙酸）0.1 mg/L～0.2 mg/L + 白砂糖 30 g/L + 卡拉胶 5.5 g/L。 5.1.3 继代增殖培养基 MS＋6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L～0.2 mg/L ＋ 白砂糖 30 g/L + 卡拉胶 5.5 g/L。 5.1.4 生根培养基 1/2 MS ＋ IBA 0.1 mg/L～0.5 mg/L + 白砂糖 20 g/L + 琼脂粉 5.0 g/L。 培养基配制 5.2.1 按 NY/T 2306 的规定执行。 5.2.2 用 1.0 mol/L NaOH 或HCl调节培养基 pH 值至 5.8。 5.2.3 每瓶分装培养基厚度 0.8 cm～1.0 cm。 6 灭菌 培养基灭菌 培养基应于 12 h 内置于高压灭菌锅内，在 1.1 kg/cm2、121℃条件下，灭菌 15 min～20 min，待 压力降至 0 时，尽快取出存放在接种室中指定位置备用。 接种工具灭菌 将剪刀、镊子等接种工具包扎好置于高压灭菌锅内，在 1.1 kg/cm2、121℃条件下，灭菌 15 min～ 20 min，待压力降至 0 时，取出放置在超净工作台上。 超净工作台灭菌 将灭菌的培养基和接种工具放置在超净工作台上，接通电源，打开超净工作台上的紫外灯灭菌 25 min～30 min，先启动风机，再关闭紫外灯。接种前，工作台面用 70％乙醇擦拭一遍。 7 无菌苗初代培养 DB34/T 4315 —2022 3 外植体选取 选用生长健壮、无病虫害的甜叶菊植株，取顶端长 5～6 节的茎段为外植体备用。 外植体清洗 将选取的外植体用 2 ‰～5‰洗衣粉溶液清洗茎段表面污垢后，在自来水下流水冲洗 10 min～15 min。 外植体消毒 在超净工作台上，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，浸入 70％乙醇中消毒 25 s～30 s后，将 70％ 乙醇倒去，用无菌水冲洗 2 次后，再浸入有效氯浓度 2.0％次氯酸钠溶液消毒 15 min～20 min，倒出 次氯酸钠溶液后，再用无菌水冲洗 4～5 次，置于无菌滤纸上备用。 外植体接种 7.4.1 接种工具消毒 接种时，剪刀、手术刀和镊子等接种工具保持无菌状态。 7.4.2 外植体切取 将已消毒的外植体切除下端部分及上端幼叶，留取长 1.5 cm～2.0 cm 带侧芽茎段备用。 7.4.3 接种 将切取的茎段接种在诱导培养基上。每瓶培养基接种 2～3 个茎段，做好编号等信息标记。 培养条件 培养温度为 23℃～27℃，光照强度 2 000 lx～3 000 lx，连续定时光照时间 12 h/d。 培养时间 培养 25 d～30 d。 8 继代增殖培养 转接 将生长健壮的无菌甜叶菊幼苗切成单株，转接至继代增殖培养基上。 培养条件 同 7.5。 培养时间 培养 25 d～30 d。 培养代数 继代增殖次数控制在 15 代以内。 DB34/T 4315 —2022 4 9 生根培养 转接 选取生长健壮、长势均匀，苗高 2.0 cm～3.0 cm 的继代培养苗，转接到生根培养基中。 培养条件 同 7.5。 培养时间 培养 18 d～20 d。 10 炼苗 炼苗时期 培养瓶内组培苗长出 4～5 条长 2.0 cm～5.0 cm 不定根时，便可炼苗。 炼苗条件 培养瓶放置在遮光率为 70％～75％、相对湿度为 70％～90％、温度为 20℃～30℃的温室中，打 开或半打开培养瓶盖炼苗。 炼苗时长 炼苗 2 d～3 d。 11 组培苗清洗和移栽 用自来水将炼苗后的组培苗基部的培养基冲洗干净后，移栽至已灭菌的基质中。 12 档案管理 按 LY/T 2289 的规定执行。