2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 猪 附 红 细 胞 体 病 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 1 9 5 3 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e f o r M y c o p l a s m a s u i s ( E p e r y t h r o z o o n s u i s ) i n f e c t i o n Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 1 9 5 3 — 2 0 0 4NY/T１９５３—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 引言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　生物安全措施 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　临床诊断 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　样品采集、保存与运输 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　涂片镜检 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　PCR检测方法 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　实时荧光PCR检测方法 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　荧光RAA检测方法 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １２　间接ELISA抗体检测方法 ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １３　阻断ELISA抗体检测方法 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １４　综合判定 ８ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　PCR反应溶液的配制 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(资料性)　猪附红细胞体PCR扩增产物电泳图、荧光PCR及荧光RAA扩增曲线图 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(资料性)　重组表达猪附红细胞体p４０蛋白的制备及鉴定 １２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　猪附红细胞体阳性对照(阳性血清)、阴性对照(阴性血清)的制备及鉴定 １３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E(规范性)　ELISA反应溶液的配制 １４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录F(资料性)　猪附红细胞体p４０单克隆抗体的制备 １５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T１９５３—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替NY/T１９５３—２０１０«猪附红细胞体病诊断技术规范»,与NY/T１９５３—２０１０相比,除结构 调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　更改了标准名称(见标准名称,２０１０年版的标准名称); b)　更改了范围(见第１章,２０１０年版的第１章); c)　增加了规范性引用文件(见第２章); d)　增加了缩略语(见第４章); e)　增加了生物安全措施(见第５章); f)　增加了疑似猪附红细胞体感染判定(见６􀆰４); g)　增加了样品采集、保存与运输(见第７章); h)　删除了样品的采集(见２０１０年版的２􀆰３􀆰３); i)　增加了疑似猪附红细胞体感染判定(见８􀆰３); j)　更改了核酸提取(见９􀆰５,２０１０年版的２􀆰３􀆰５); k)　增加了荧光RAA检测方法(见第１１章); l)　增加了间接ELISA抗体检测方法(见第１２章); m)　增加了阻断ELISA抗体检测方法(见第１３章); n)　更改了综合判定(见第１４章,２０１０年版的第３章). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:河南省动物疫病预防控制中心、河南省畜产品质量监测检验中心、青岛立见生物科 技有限公司、苏州吉玛基因股份有限公司. 本文件主要起草人:闫若潜、吴志明、班付国、王淑娟、马震原、刘梅芬、王东方、刘影、赵雪丽、朱前磊、 方先珍、王英华、袁淑萍、刘先敏、柴茂、杨海波、王翠、刘敏、曹伟伟、刘光辉、苗连叶、王华俊、苑述友、房大 学、孙荣钊、赵美雪、张利平、靳冬、国立浩. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１０年首次发布为NY/T１９５３—２０１０; ———本次为第一次修订. ⅡNY/T１９５３—２０２５ 引　　言 猪附红细胞体病是由猪附红细胞体[Mycoplasmasuis(Eperythrozoonsuis)]寄生于猪红细胞表面 或游离于血浆、组织液及脑脊液中引起的人畜共患传染性疾病.猪附红细胞体可引起患猪出现发烧、皮肤 红紫、贫血、黄疸、咳嗽等一系列症状,造成猪群生产性能下降、免疫力低下、死亡率增加.该病不仅制约了 我国畜牧业健康发展,也对人类健康和公共卫生安全造成威胁,我国将其列为三类动物疫病. 随着对猪附红细胞体病诊断需求的增加和诊断技术的发展,现行«猪附红细胞体病诊断技术规范» (NY/T１９５３—２０１０)已不能满足实际生产需要,需增加荧光RAA等病原学现场快检方法、ELSIA等血清 学检测方法.由于目前尚无针对猪附红细胞体病的疫苗,因此,疑似猪附红细胞体感染动物经检测抗体阳 性即可确诊感染. ⅢNY/T１９５３—２０２５ 　 　 　猪附红细胞体病诊断技术 １　范围 本文件规定了猪附红细胞体病的生物安全措施,临床诊断,样品采集、保存与运输,涂片镜检,实时荧 光PCR检测方法,荧光RAA检测方法,间接ELISA抗体检测方法,阻断ELISA抗体检测方法,综合判 定. 本文件适用于对猪附红细胞体病的诊断. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用本文件. GB１９４８９　实验室生物安全通用要求 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. DEPC:焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphates) ELISA:酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay) E􀆰suis:猪附红细胞体(eperythrozoonsuis) OD:光密度(opticaldensity) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RAA:重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinaseaidedamplification) ５　生物安全措施 进行猪附红细胞体实验室检测时,如样品处理、核酸提取等,生物安全措施应按照GB１９４８９的规定 执行. ６　临床诊断 ６􀆰１　流行病学 ６􀆰１􀆰１　易感动物 不同年龄、性别、品种的猪均易感,还可感染人及绵羊、牛、鼠、猫等多种动物. ６􀆰１􀆰２　传染源 发病猪和隐性感染猪是本病的传染源. ６􀆰１􀆰３　传播途径 主要通过吸血昆虫传播,或通过血液污染的针头和器械传播,也可垂直传播. ６􀆰１􀆰４　发病规律 １NY/T１９５３—２０２５ 本病一年四季均可发生,尤其是夏秋季节. ６􀆰２　临床症状 ６􀆰２􀆰１　发热,体温升高到４０℃~４２℃,食欲下降,精神委顿,呼吸困难,排棕红色尿液. ６􀆰２􀆰２　感染初期皮肤潮红,后期背部及四肢末梢发绀,特别是耳廓边缘发绀. ６􀆰２􀆰３　贫血,全身皮肤及可视黏膜苍白或黄染. ６􀆰２􀆰４　慢性病猪表现消瘦、苍白,部分猪出现荨麻疹或病斑型皮肤变态反应. ６􀆰２􀆰５　血液稀薄,凝固不良,红细胞数量减少. ６􀆰２􀆰６　新生仔猪衰竭,母猪繁殖障碍. ６􀆰３　病理变化 ６􀆰３􀆰１　贫血和黄疸,全身肌肉色泽变淡,脂肪及肺、胸腔、胃、肠、膀胱等内脏器官浆膜有不同程度的黄染. ６􀆰３􀆰２　淋巴结