2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 大 豆 品 种 真 实 性 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 2 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 2 5 9 5 — 2 0 2 5 S o y b e a n [ G l y c i n e m a x ( L . ) M e r r . ] v a r i e t y g e n u i n e n e s s i d e n t i f i c a t i o n — S S R - b a s e d m e t h o d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T２５９５—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　检测方案 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　仪器设备、试剂和溶液配制 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　检测程序 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　鉴定意见 ８ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　结果报告 ８ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(资料性)　溶液配制 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(资料性)　３８对标记荧光的SSR引物分组方案 １２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(资料性)　３８对SSR引物等位变异信息(毛细管电泳) １３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　参照品种名单 １７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T２５９５—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规则 起草. 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC３７)归口. 本文件起草单位:全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院作物科学研究所、黑龙江省种业技术 服务中心、山西省农业种子总站、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、河北省种子管理总站、安徽省种子管 理总站. 本文件主要起草人:邱丽娟、刘丰泽、关荣霞、任雪贞、郭潇阳、刘谢香、王羡国、孟全业、邓澍、郑静宜、 张文晓、孙全、金石桥、晋芳. ⅡNY/T２５９５—２０２５ 　 　 　大豆品种真实性鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了大豆[Glycinemax(L􀆰)Merr􀆰]品种真实性鉴定(simplesequencerepeat,SSR)分子 标记法术语和定义、原理、检测方案、检测程序和结果报告. 本文件适用于大豆品种真实性验证和品种真实性身份鉴定,不适用于实质性派生品种(EssentialdeＧ rivedvariety,EDV)的鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰１　农作物种子检验规程　总则 GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　扦样 GB/T３５４３􀆰５　农作物种子检验规程　真实性和品种纯度鉴定 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 品种真实性　varietygenuineness 供检样品与标准品种是否相符. ３􀆰２　 品种真实性验证　varietyverification 与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实供检样品的品种名称与标注是否相符. ３􀆰３　 品种真实性身份鉴定　varietyidentification 经分子技术检测并通过相应品种指纹数据比对平台筛查比较,确定供检样品的真实品种名称. ３􀆰４　 标准样品　standardsample 国家指定机构保存的代表品种特征特性的实物样品或DNA样品. ３􀆰５　 SSR指纹数据比对平台　SSRfingerprintblastplatform 采用SSR标记的标准化方法对品种标准样品的等位变异进行检测,并运用计算机数据库技术和网络 信息技术所构建的品种分子数据信息的检索比对载体. ３􀆰６　 参照样品　referencesample 具有SSR位点上主要等位变异的品种,用于辅助确定试验样品的等位变异,校正仪器设备的系统误差. ３􀆰７　 引物组合　primerpanel 最大限度区分大豆品种的一套引物. １NY/T２５９５—２０２５ ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphate) PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat) Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase) ５　原理 大豆不同品种的基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)的重复次数差异.这种差异 可以通过从有代表性的试验样品中提取DNA,用SSR引物进行扩增和电泳检测出来,因此,可以利用扩 增片段大小区分不同品种. 依据SSR标记检测原理,采用SSR引物,通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比对的方 式,对品种真实性进行验证或身份鉴定.真实性验证依据规定数目引物的SSR位点差异数目而判定,品 种真实性身份鉴定依据被检SSR位点无差异原则进行筛查和鉴定. ６　检测方案 ６􀆰１　总则 对于真实性鉴定,引物、检测平台、样品状况不同,其检测结果的准确度、精确度可能有所不同.应依 据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,选定适宜的检测平台、样品状况,制订相应的检 测方案. 在严格控制条件下,合成选择的引物,按照确定的检测平台对试验样品按DNA提取、PCR扩增、电 泳、数据分析的程序进行检测. 按规定要求填报检测结果,检测报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息. DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照检 测平台的要求,允许对本文件的规定做适当调整. ６􀆰２　检测平台 ６􀆰２􀆰１　品种真实性验证可采用变性PAGE垂直板电泳或者毛细管电泳,PAGE电泳宜在同一电泳板 上比较试验样品和标准样品;真实性身份鉴定,宜采用毛细管电泳,利用SSR指纹数据比对平台进行鉴 定. ６􀆰２􀆰２　对于试验样品数量较多的,可将组织研磨仪、DNA自动提取、自动移液工作站、高通量PCR扩增 仪、DNA分析仪进行组合,以提高检测的综合效率. ６􀆰３　引物 ６􀆰３􀆰１　开发３８对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的引物(见表１). 表１　引物信息 编号引物名称染色体退火温度,℃ 引物序列(５′Ｇ３′) PG０１Gm０１６ ９ ６０正向:AGTTAGGGTGATCAGAAAACTGTAA 反向:GATTGCTCCAACGTATTAAGCACTT PG０２Gm００８ ５ ６０正向:TGAAACCTGGAAAAAGATACGTGTG 反向:GTTGAAGGAAATGCTTCAAACCAAC ２NY/T２５９５—２０２５ 表１(续) 编号引物名称染色体退火温度,℃ 引物序列(５′Ｇ３′) PG０３Gm０３４１８ ６０正向:AGTTGGTGTTTTCTTGTGGTTTTCT 反向:CGTACTCTGTACTGGGAGCTAATTA PG０４Gm０２３１３ ６０正向:TTTATGACTCTTTGCAGCAAGAAGG 反向:AATGATCTAATGTGTGACCATGCAC PG０５Gm０３９２０ ６０正向:TGCTTCCCTATGCAAAAAGATTGAG 反向:TCAAGTATGGTGGAAAA