2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 棉 花 品 种 真 实 性 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 2 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 2 6 3 4 — 2 0 2 2 C o t t o n （ G o s s y p i u m s p p L . ） v a r i e t y g e n u i n e n e s s i d e n t i f i c a t i o n — S S R b a s e d m e t h o d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 ´úÌæ N Y / T 2 6 3 4 — 2 0 1 4NY/T２６３４—２０２２ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　检测方案 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　仪器设备、试剂和溶液配制 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　检测程序 ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　鉴定意见 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　结果报告 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(资料性)　溶液配制 １１ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(资料性)　等位变异扩增片段信息 １３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(资料性)　６０对SSR引物四色荧光分组方案 １９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　参照样品名单 ２０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T２６３４—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件为NY/T２６３４—２０１４«棉花品种真实性鉴定　SSR分子标记法»的修订版,在棉花品种真实性 鉴定过程中参考使用.本文件代替NY/T２６３４—２０１４«棉花品种真实性鉴定　SSR分子标记法»,与NY/ T２６３４—２０１４相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　调整了“范围”(见第１章); b)　调整了“规范性引用文件”(见第２章); c)　调整了“术语和定义”(见第３章); d)　增加了“缩略语”(见第４章); e)　调整了“原理”(见第５章); f)　增加了“检测方案”(见第６章); g)　调整了“引物”(见６􀆰３); h)　调整了“仪器、设备和溶液配制”(见第７章); i)　调整了“检测程序”(见第８章); j)　增加了“鉴定意见”(见第９章); k)　增加了“结果报告”(见第１０章); l)　调整了“溶液配制”(见附录A); m)　调整了“等位变异扩增片段信息”(见附录B); n)　增加了“引物分组信息”(见附录C); o)　增加了“参照样品名单”(见附录D); 本文件由农业农村部种业管理司提出并归口. 本文件起草单位:全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院棉花研究所、安徽省农业科学院. 本文件主要起草人:匡猛、晋芳、吴玉珍、金石桥、彭军、黄龙雨、何团结、魏守军、周大云、王延琴、黄义 文、郑曙峰、张力科、刘丰泽、任雪贞、赖波、周明冬、李曼、王峰、侯新河、辜立新、聂新辉、艾先涛、孔德培、付 小琼、李超. ⅡNY/T２６３４—２０２２ 棉花品种真实性鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(simplesequencerepeat,SSR)分子标记法进行棉花(Gossypium sppL􀆰)品种真实性检测的术语和定义,缩略语,原理,检测方案,仪器设备、试剂和溶液配制,检测程序,鉴 定意见和结果报告. 本文件适用于陆地棉(G􀆰hirsutum)和海岛棉(G􀆰barbadense)品种真实性验证和品种真实性身份鉴 定,不适用于实质性派生品种(essentialderivedvarieties,EDV)的鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰１　农作物种子检验规程　总则 GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　扦样 GB/T３５４３􀆰５　农作物种子检验规程　真实性和品种纯度鉴定 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 品种真实性验证　varietyverification 与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实供检样品品种名称与标注是否相符. ３􀆰２　 品种真实性身份鉴定　varietyidentification 通过与标准样品DNA指纹数据库比对或筛查,确定送验样品的真实品种名称. ３􀆰３　 标准样品　standardsample 国家指定机构保存的具有法定身份的代表品种特征特性的实物种子或DNA样品. ３􀆰４　 参照样品　referencesample 携带SSR位点上主要等位变异的品种,用于辅助确定试验样品的等位变异,校正仪器设备的系统 误差. ３􀆰５　 引物组合　primerpanel 具有不同荧光颜色或相同荧光颜色而扩增片段大小不同、能够组合在一起进行电泳的一组荧光标记 引物. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair) １NY/T２６３４—２０２２ CI:氯仿∶异戊醇(Chloroform∶３ＧMethylＧ１Ｇbutanol)(V１∶V２＝２４∶１) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis) PCI:苯酚∶氯仿∶异戊醇(Phenol∶Chloroform∶３ＧMethylＧ１Ｇbutanol)(V１∶V２∶V３＝２５∶２４∶１) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate) SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat) TBE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ硼酸盐Ｇ乙二胺四乙酸二钠(TrisＧBorateＧEDTA) Tris:三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase) ５　原理 棉花的不同品种,其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单重复序列(SSR)的重复次数差异.这种 差异可以从抽取有代表性的试验样品中提取DNA,用SSR引物进行扩增和电泳检测,从而利用扩增片段 大小不同而加以区分品种. 依据SSR标记检测原理,采用SSR引物,通过与标准样品SSR指纹数据比对或筛查的方式,对品种 真实性进行验证或身份鉴定.品种真实性验证依据SSR位点差异数目而判定,品种真实性身份鉴定依据 被检SSR位点无差异原则进行筛查、鉴定. ６　检测方案 ６􀆰１　总则 对于真实性鉴定,引物、检测平台、样品状况不同,其检测结果的准确度、精确度可能有所不同.应依 据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,选择适宜的引物、检测平台、样品状况,制定相 应的检测方案. 按规定要求填报检测结果,检验报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息. DNA提取、PCR扩增和电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照检 测平台的要求允许对本文件的规定做适宜调整. ６􀆰２　检测平台 ６􀆰２􀆰１　对于棉花品种真实性验证,可采用变性PAGE垂直板电泳或者毛细管电泳,宜在同一电泳板上比 较试验样品和标准样品;对于真实性身份鉴定,宜采用毛细管电泳.如需利用SSR指纹数据库,则需要利 用参照品种确定试验样品的指纹后再进行真实性身份鉴定. ６􀆰２􀆰２　对于样品数量较大的,可将组织研磨仪、DNA自动提取