2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 易 挥 发 化 学 农 药 对 蚯 蚓 急 性 毒 性 试 验 准 则 1 7 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 C C S B 4 1 8 5 — 2 0 2 2 V o l a t i l e c h e m i c a l p e s t i c i d e — G u i d e l i n e f o r e a r t h w o r m Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４１８５—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件负责起草单位:农业农村部农药检定所、中国农业科学院植物保护研究所. 本文件主要起草人:毛连纲、周欣欣、袁善奎、程燕、张兰、卜元卿、张燕宁、王宏伟、陈朗、陈红英、 田建利. ⅠNY/T４１８５—２０２２ 易挥发化学农药对蚯蚓急性毒性 试验准则 １　范围 本文件规定了易挥发化学农药对蚯蚓急性毒性试验的方法、质量控制、试验报告等的基本要求. 本文件适用于为易挥发化学农药(熏蒸剂类)登记而进行的蚯蚓急性毒性试验. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T２８９０呼吸防护　自吸过滤式防毒面具 GB/T６６８２分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 生殖带　clitellum 蚯蚓身体前端表皮上的一种腺体,为鞍状或环带状,通常可通过颜色与蚯蚓身体其他部分区分开. ３􀆰２　 成蚓　adultworm 身体前端呈现出生殖带的蚯蚓. ３􀆰３　 易挥发化学农药　volatilechemicalpesticides 自身易挥发或在施入土壤后容易产生易挥发物质的一类化学农药,而易挥发物质即亨利常数(H)或 空气/水分配系数大于１或蒸气压在２５℃时超过０􀆰０１３３Pa的物质. ３􀆰４　 半数致死浓度　medianlethalconcentration 引起５０％供试生物死亡时的供试物浓度,用LC５０表示. 注:单位为毫克有效成分每千克干土(mga􀆰i􀆰/kg干土). ４　试验概述 在含有适量人工土壤的密闭容器中放入蚯蚓,待蚯蚓钻入土壤后,施用被试物,在适宜条件下密闭培 养２周,并观察记录蚯蚓的中毒症状和死亡数,求出农药对蚯蚓的半致死浓度LC５０及９５％置信限. ５　试验方法 试验操作人员在称量和施用被试物过程中,应佩戴对被试物具有阻隔效果的防毒面具并穿戴防护服. 防毒面具性能应符合GB/T２８９０的要求.施药过程中如有刺激流泪现象或闻到刺激性气味,应立即离开 施药区域,并检查或更换防毒面具. ５􀆰１　材料和仪器 除另有规定外,水为符合GB/T６６８２中规定的一级水. ５􀆰１􀆰１　供试生物 １NY/T４１８５—２０２２ 推荐选择赤子爱胜蚯蚓(Eiseniafetida)成蚓进行试验,体重在０􀆰３０g~０􀆰６０g. ５􀆰１􀆰２　供试土壤 人工土壤,配制方法见附录A. ５􀆰１􀆰３　被试物 被试物为易挥发化学农药制剂或原药.难溶于水的液体类药剂可用少量对蚯蚓毒性小的有机溶剂助 溶后再溶于水进行稀释;固体类药剂可以通过适量的石英砂(５０μm~２００μm颗粒含量大于５０％)来稀释 并混匀. ５􀆰１􀆰４　仪器设备 ５􀆰１􀆰４􀆰１　人工气候室; ５􀆰１􀆰４􀆰２　电子天平(感量０􀆰０００１g); ５􀆰１􀆰４􀆰３　移液器; ５􀆰１􀆰４􀆰４　密闭容器(推荐玻璃干燥器,规格为器口内径１６０mm,对应容积２􀆰５L); ５􀆰１􀆰４􀆰５　防毒面具; ５􀆰１􀆰４􀆰６　容量瓶等. ５􀆰２　试验步骤 ５􀆰２􀆰１　预试验 按正式试验的条件,以较大的间距设若干组浓度,求出被试物对蚯蚓全致死的最低浓度和全存活的最 高浓度,在此范围内设置正式试验的浓度. ５􀆰２􀆰２　正式试验 ５􀆰２􀆰２􀆰１　在预试验确定的浓度范围内按一定级差等比设置５个~７个浓度组(最大级差不超过２),并设 置一个空白对照组(使用助溶剂的应增设溶剂对照组),每个浓度组均至少设３个重复. ５􀆰２􀆰２􀆰２　用蒸馏水调节人工土壤含水量至其最大持水量(测定方法见附录B)的６５％~８５％,称取相当 于５００g干土重的上述已配制人工土壤放入干燥器中,每个重复放入１０条蚯蚓. ５􀆰２􀆰２􀆰３　液体类药剂直接通过移液器移取后注射入容器中间位置的土壤中;用量非常低而无法直接量取 时,易溶于水的液体类药剂可以通过溶于水进行稀释;难溶于水的液体类药剂可用少量对蚯蚓毒性小的有 机溶剂助溶后再溶于水进行稀释,有机溶剂用量一般不得超过０􀆰１mL/L.固体类药剂直接通过电子天 平称取所需用量后均匀混入土壤中;用量非常低而无法直接称取时,固体类药剂可以通过适量的石英砂来 稀释. ５􀆰２􀆰２􀆰４　施入药剂后,迅速密闭容器,将干燥器放置于２０℃±２℃、光照度４００lx~８００lx的人工气候室 中.１４d后倒出瓶内土壤,观察记录蚯蚓的中毒症状和死亡数(用针轻触蚯蚓尾部,蚯蚓无反应则为死 亡).根据蚯蚓１４d的死亡率,求出农药对蚯蚓的毒性LC５０及９５％置信限. ５􀆰２􀆰３　限度试验 设置上限浓度１０００mga􀆰i􀆰/kg干土,若未见蚯蚓死亡,则无需继续进行试验. ５􀆰２􀆰４　参比试验 为检验实验室的设备、条件、方法、供试生物、供试土壤的质量是否合乎要求,应设置参比物质作为本 准则方法学上的可靠性检验,参比物质为棉隆. ５􀆰３　数据处理 ５􀆰３􀆰１　统计分析方法的选择 可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法计算得到每一观察时间(１４d)的LC５０和９５％置信限, 也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算. ５􀆰３􀆰２　寇氏法 用寇氏法可求出蚯蚓在１４d的LC５０及９５％置信限. LC５０的计算见公式(１). ２NY/T４１８５—２０２２ logLC５０＝Xm－i(∑P－０􀆰５) (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: Xm———最高浓度的对数; i———相邻浓度比值的对数; ∑P———各组死亡率的总和(以小数表示). ９５％置信限的计算见公式(２). ９５％置信限＝logLC５０±１􀆰９６SlogLC５０ (２) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: S———标准误. 标准误的计算见公式(３). SlogLC５０＝i　 ∑pq n(３) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: p———１个组的死亡率,单位为百分号(％); q———１－p,单位为百分号(％); n———各浓度组蚯蚓的数量,单位为条. ５􀆰３􀆰３　直线内插法 采用线性刻度坐标,绘制死亡百分率对被试物浓度的曲线,求出５０％死亡时的LC５０. ５􀆰３􀆰４　概率单位图解法 用半对数纸,以浓度对数为横坐标,死亡百分率对应的概率单位为纵坐标绘图.将各实测值在图上用 目测法画一条相关直线,从直线中读出致死５０％的浓度对数,估算出LC５０. ６　质量控制 质量控制条件应包括: a)　空白对照组或溶剂对照组死亡率均不超过１０％; b)　参比试验中棉隆对蚯蚓试验开始后１４d的LC５０应在１mga􀆰i􀆰/kg干土~８mga􀆰i􀆰/kg干土. ７　试验报告 试验报告至少应包括下列内容: a)　被试物的信息,包括被试农药的通用名、化学名称、结构式、CAS号、纯度、基本理化性质、来源等; b)　被试生物的名称、来源、大小及健康情况; c)　试验条件,包括试验温度、光照等; d)　被试土壤中的被试物浓度及试验开始后１４d的LC５０和９５％置信限,并给出所采用的计算方法; e)　对照组蚯蚓的死亡率、行为反应异常的比例; f)　注明人工土壤配方与配制方法. ３NY/T４１８５—２０２２ 附　录　A (资料性) 人工土壤组成成分及配比 　 人工土壤组成成分及配比见表A􀆰１ 表A􀆰１　人工土壤组成成分及配比 成分 含量,％ 说明 泥炭藓 １０ pH５􀆰５~６􀆰０ 高岭土 ２０ 高岭石含量大于３０％ 石英砂 ６８ ５０μm~２００μm颗粒含量大于５０％ 碳酸钙 ２ 调节人工土壤pH至６􀆰０±０􀆰５ ４