2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 梨 品 种 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 2 0 1 — 2 0 2 2 I d e n t i f i c a t i o n o f p e a r v a r i e t i e s — S S R - b a s e c l m e t h o d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４２０１—２０２２ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　仪器设备及试剂 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　溶液配制 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　位点 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　参照品种 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　数据采集 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果判定 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A　(规范性)仪器设备及试剂 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B　(规范性)溶液配制 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C　(规范性)核心位点相关信息 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D　(资料性)参照品种名单 １１ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４２０１—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院果树研究所. 本文件主要起草人:王斐、姜淑苓、欧春青、张艳杰、马力、杨冠宇、李佳纯. ⅡNY/T４２０１—２０２２ 　 　 　梨品种鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(simplesequencerepeats,SSR)分子标记进行梨(PyrusL􀆰)品种鉴 定的试验方法、数据采集及判定方法. 本文件适用于基于SSR分子标记的梨品种DNA分子数据采集和品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T１９５５７􀆰１　植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南　总则 GB/T１９５５７􀆰３０　植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南　梨 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T２５９４　植物品种鉴定　DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４界定的术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 核心位点　corelocus 品种鉴定时优先选用的一组SSR位点,具有多态性高、重复性好、分布均匀的特点. ３􀆰２　 参照品种　referencevariety 代表核心位点主要等位变异的一组样品.用于辅助确定待测样品在某个位点上等位变异扩增片段的 大小,矫正仪器设备的系统误差. ４　原理 SSR广泛分布于梨基因组中,不同品种间每个SSR位点重复单位的数量可能不同.针对重复序列两 侧序列高度保守的特点,设计一对特异引物,利用聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术 对重复序列进行扩增.在电泳过程中,由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度的PCR扩增 片段,在电场作用下得到分离,经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分.因此,根据SSR位点的多态 性,利用PCR扩增和电泳技术可以鉴定梨品种. ５　仪器设备及试剂 仪器设备及试剂见附录A. ６　溶液配制 溶液配制方法见附录B. ７　位点 位点相关信息见附录C. １NY/T４２０１—２０２２ ８　参照品种 参照品种的名称见附录D. ９　操作程序 ９􀆰１　样品准备 样品为梨的叶片、枝条或其他等效物,每份样品检测不少于５个单株,混合分析.必要时,对单株进行 单独分析. ９􀆰２　DNA提取 称取０􀆰２g幼嫩叶片,放入研钵中,加入液氮迅速研磨至粉末状,立即装入２􀆰０mL离心管中,加入 ５００μL于６５℃预热的DNA提取液和０􀆰４％的βＧ巯基乙醇,摇匀,在６５℃水浴３０min~４５min,其间轻 摇颠倒２次~３次;取出离心管,自然冷却至室温,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(２５∶２４∶１,V∶V∶V), 颠倒混匀,１２０００g离心１０min;将上清液转移至新的离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(２４∶１,V∶ V),颠倒混匀,１２０００g离心１０min;取上清液,加入２倍体积的无水乙醇(于－２０℃预冷)和１/１０体积的 ３mol/L醋酸钠,颠倒混匀,于－２０℃放置３０min;挑出沉淀,放入新离心管中,并用７０％乙醇洗２次,倒 掉乙醇,在超净工作台上风干;加入４００μLTE溶液,待沉淀完全溶解后,加入２μLRNaseA(１０mg/ mL),３７℃水浴３０min;加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(２５∶２４∶１,V∶V∶V),颠倒混匀,１２０００g离心 １０min;将上清液转移至新的离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(２４∶１,V∶V),颠倒混匀,１２０００g离 心１０min;取上清液,加入２倍体积的无水乙醇(于－２０℃预冷)和１/１０体积的３mol/L醋酸钠,颠倒混 匀,于－２０℃放置３０min;挑出沉淀,放入新离心管中,并用７０％乙醇洗２次,倒掉乙醇,在超净工作台上 风干;加入５０μLTE溶液,溶解DNA,检测DNA的浓度和纯度.于－２０℃保存备用. 注:其他所获DNA质量能够满足PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本文件. ９􀆰３　PCR扩增 ９􀆰３􀆰１　反应体系 ２５μL的反应体系含每种dNTP０􀆰２mmol/L,正向引物和反向引物各０􀆰５μmol/L,TaqDNA聚合 酶１􀆰０U,１０×PCR缓冲液(含Mg２＋)２􀆰５μL,样品DNA５０ng. 利用毛细管电泳荧光检测时使用荧光标记引物.引物的荧光染料种类见附录C. 注:反应体系的体积可以根据具体情况进行调整. ９􀆰３􀆰２　反应程序 ９４℃预变性５min;９４℃变性３０s,按附录C推荐的引物退火温度退火３０s,７２℃延伸３０s,共３５个 循环;７２℃延伸１０min,４℃保存. ９􀆰４　PCR产物检测 ９􀆰４􀆰１　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ９􀆰４􀆰１􀆰１　玻璃板处理 将玻璃板清洗干净,用去离子水冲洗后晾干.用无水乙醇擦洗２遍,吸水纸擦干.在长板上涂上０􀆰５ mL亲和硅烷工作液,带凹槽的短板上涂０􀆰５mL剥离硅烷工作液.操作过程中防止两块玻璃板互相污 染.待玻璃板彻底干燥后,将塑料隔条整齐放在平板两侧,盖上凹板,用夹子固定后,用水平仪调平. ９􀆰４􀆰１􀆰２　灌胶 取１００mL６􀆰０％变性聚丙烯酰胺凝胶溶液(根据不同型号的电泳槽确定胶的用量和合适的灌胶方 式),分别加入５０μLTEMED和５００μL１０％的过硫酸铵溶液,轻轻混匀后灌胶.待胶液充满玻璃板夹 层,将０􀆰４mm厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻插入胶液约０􀆰４cm.灌胶过程中防止出现气泡.使胶液聚 合至少１h以上.胶聚合后,清理胶板表面溢出的胶液,轻轻拔出梳子,用水清洗干净备用. ９􀆰４􀆰１􀆰３　预电泳 将胶板与电泳槽装配好,在电泳槽中加入１×TBE缓冲液(具体用量视电泳槽型号而定).８０W恒功 ２NY/T４２０１—２０２２ 率预电泳３０min. ９􀆰４􀆰１􀆰４　PCR扩增产物变性处理 在PCR产物中加入１０μL上样缓冲液,混匀后,在PCR仪上９５℃变性５min,取出,迅速置于碎冰上. ９􀆰４􀆰１􀆰５　电泳 清除凝胶顶端的气泡和聚丙烯酰胺碎片.将梳齿端插入凝胶１mm~２mm.每一个点样孔点入 ５μL扩增产物.除待测样品外,还应同时加入参照品种的扩增产物.在６０W~８０W恒功率下电泳,使凝 胶温度保持在５０℃左右.电泳１􀆰５h~２