2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 菜 豆 品 种 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 2 0 2 — 2 0 2 2 I d e n t i f i c a t i o n o f f r e n c h b e a n v a r i e t i e s — S S R - b a s e c l m e t h o d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４２０２—２０２２ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　主要仪器设备及试剂 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　溶液配制 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　引物相关信息 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　参照品种 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　操作程序 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　数据统计 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果判定 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A　(规范性)仪器设备及试剂 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B　(规范性)溶液配制 ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C　(规范性)核心引物名单及序列 ８ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D　(规范性)核心引物相关信息 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录E　(资料性)核心引物分组 １４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录F　(资料性)参照品种相关信息 １５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４２０２—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、湖南农业大学、中国农业科学院作物科学研究所、中国农 业科学院蔬菜花卉研究所. 本文件主要起草人:韩瑞玺、武晶、陈琼、杨礼胜、马莹雪、王兰芬、杨坤、唐浩、王述民、张凯淅、李嫒嫒、 冯艳芳、刘明月. ⅡNY/T４２０２—２０２２ 　 　 　菜豆品种鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(simplesequencerepeats,SSR)标记进行菜豆(Phaseolusvulgaris L􀆰)品种鉴定的操作程序、结果统计和结果判定. 本文件适用于菜豆品种SSR指纹数据采集和品种鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件. 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 NY/T２４２７　植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南　菜豆 NY/T２５９４　植物品种鉴定DNA分子标记法　总则 ３　术语和定义 NY/T２５９４规定的术语和定义适用于本文件. ４　原理 不同菜豆基因组中SSR的重复次数存在差异,这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测,进而 区分不同的菜豆品种. ５　主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A. ６　溶液配制 溶液配制见附录B. ７　引物相关信息 核心引物名单及序列见附录C,核心引物相关信息见附录D,核心引物分组见附录E. ８　参照品种 参照品种相关信息见附录F. ９　操作程序 ９􀆰１　样品准备 送验样品可为种子、幼苗、叶片等组织或器官,需要扦样时样品数量应符合GB/T３５４３􀆰２的要求.每 份样品取不少于１５个个体的叶片或其他等效物,混合分析,必要时进行单个个体检测. ９􀆰２　DNA提取 CTAB提取法:取幼苗或叶片２００mg~３００mg,置于２􀆰０mL离心管,加液氮充分研磨;每管加入６００ μL６５℃预热的CTAB提取液充分混合,６５℃恒温水浴４５min~６０min,每间隔１０min颠倒混匀１次;每 管加入等体积的氯仿Ｇ异戊醇(２４∶１,V∶V),轻缓混匀后,静置１０min;１２０００g离心１５min后,吸取上 １NY/T４２０２—２０２２ 清液至新的离心管,再加入等体积预冷的异丙醇,颠倒离心管数次,在－２０℃放置３０min;４℃,１２０００g 离心１０min,弃上清液;用７０％乙醇洗涤DNA沉淀２次,风干,加入１００μL无菌水或TE缓冲液.检测 DNA浓度和质量,－２０℃保存. 注:以上为推荐的DNA提取方法,所获DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均 适用. ９􀆰３　PCR扩增 ９􀆰３􀆰１　反应体系 各组分终浓度如下:每种dNTP０􀆰２０mmol/L,正向、反向引物各０􀆰２５μmol/L,TaqDNA聚合 酶０􀆰０５U/μL,１×PCR缓冲液(含Mg２＋２􀆰５mmol/L),DNA２􀆰５ng/μL,其余以超纯水补足至所需 体积. 利用毛细管电泳进行荧光检测时需使用荧光标记的引物,荧光标记位于上游引物５′端,详见附录D. 注:反应体系的体积可根据具体情况进行调整.可采用PCR试剂盒代替TaqDNA聚合酶、 dNTP、Mg２＋. ９􀆰３􀆰２　反应程序 ９５℃预变性５min;９５℃变性４０s,５４℃退火４５s,７２℃延伸４０s,共３５个循环;７２℃延伸１０min, 产物４℃保存. ９􀆰４　PCR产物检测 ９􀆰４􀆰１　变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳(PAGE) ９􀆰４􀆰１􀆰１　制胶 蘸洗涤剂用清水将玻璃板清洗干净,再用双蒸水、７５％乙醇分别擦洗２遍.玻璃板干燥后,将１mL 亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上,将１mL疏水硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短玻璃板上,玻璃板干 燥后,将０􀆰４mm厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧,盖上凹槽短玻璃板,用夹子固定,用水平仪检查是 否水平.取８０mL６％PAGE胶溶液,加入６０μLTEMED和１８０μL１０％的过硫酸铵(过硫酸铵的用量 与室温成反比,需根据室温调整用量),轻轻摇匀(勿产生大量气泡),将胶灌满玻璃胶室,在凹槽处将鲨鱼 齿梳的平齐端向里轻轻插入胶液５mm~６mm.胶液聚合１􀆰５h后,清理胶板表面溢出的胶液,轻轻拔出 梳子,用水清洗干净备用. ９􀆰４􀆰１􀆰２　预电泳 将聚合好的胶板安装于电泳槽上,在电泳正极槽(下槽)加入６００mL的１×TBE缓冲液,负极槽(上 槽)加入６００mL的１×TBE缓冲液,１８００V恒压预电泳１０min~２０min. ９􀆰４􀆰１􀆰３　变性 在２０μLPCR产物中加入４μL６×加样缓冲液,混匀.在PCR仪上９５℃变性５min,取出迅速置于 冰上,冷却１０min以上. ９􀆰４􀆰１􀆰４　电泳 用移液器清除凝胶顶端气泡和杂质.将样品梳插入凝胶１mm~２mm.每一个加样孔点入３μL~５ μL样品,在胶板一侧点入DNAMarker.１８００V恒压电泳,电泳时间参考二甲苯青指示带移动的位置和 扩增产物预期片段大小范围(见附录D).二甲苯青指示带在６％PAG胶电泳的移动位置与２３０bp扩增 产物泳动的位置大致相当.扩增产物片段大小在(１００±３０)bp、(１５０±３０)bp、(２００±３０)bp、(２５０±３０)bp 范围的、电泳参考时间分别为１􀆰５h、２􀆰０h、２􀆰５h、３􀆰５h.电泳结束后关闭电源,取下玻璃板并轻轻撬开, 凝胶附着在长玻璃板上. ９􀆰４􀆰１􀆰５　银染 将粘有凝胶的长玻璃板胶面向上浸入“固定/染色液”中,轻摇染色槽,使“固定/染色液”均匀覆盖胶 板,置于摇床上染色５min~１０min.将胶板移入水中漂洗３０s~６０s.再移入显影液中,轻摇显影槽,使 显影液均匀覆盖胶板,待带型清晰,将胶板移入去离子水中漂洗５min,晾干胶板,放在胶片观察灯上观察 记录结果,用数码相机或凝胶成像系统拍照保存.　 ２NY/T４２０２—２０２２ ９􀆰４􀆰２　毛细管电泳 ９