2 0 2 2 1 1 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 3 0 1 － － 实 施 芒 果 品 种 鉴 定 M N P 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 2 3 4 — 2 0 2 2 I d e n t i f i c a t i o n o f M a n g o V a r i e t i e s — M N P m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４２３４—２０２２ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　试剂和材料 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　仪器设备 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　鉴定步骤 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　结果计算分析 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　芒果MNP标记引物 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４２３４—２０２２ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部农垦局提出. 本文件由农业农村部热带作物及制品标准化技术委员会归口. 本文件起草单位:中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所、江汉大学. 本文件主要起草人:李琼、何云、彭海、洪青梅、濮文辉、黄建峰、方治伟、李甜甜、周俊飞、李论、高利芬、 陈利红. ⅡNY/T４２３４—２０２２ 　 　 　芒果品种鉴定MNP标记法 １　范围 本文件描述了应用多核苷酸多态性(MNP)标记法进行芒果(MangiferaindicaLinn􀆰)品种鉴定的原 理、试剂和材料、仪器设备、鉴定步骤、结果计算分析. 本文件适用于芒果的原始品种、实质性派生品种和品种真实性的鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T３８５５１　植物品种鉴定MNP标记法 NY/T２４４０　植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南　芒果 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 多核苷酸多态性　multiplenucleotidepolymorphism,MNP 在一段不超过３００bp的核苷酸序列中,由多个核苷酸引起的序列多态性. [来源:GB/T３８５５１,３􀆰１,有修改] ３􀆰２ 芒果参考基因组　mangoreferencegenome 版本号GCA_０１１０７５０５５􀆰１的芒果基因组序列. ３􀆰３ 实质性派生品种　essentialderivedvariety,EDV 由原始品种实质性派生,或者由该原始品种的实质性派生品种派生出来的品种,与原始品种有明显区 别,除派生引起的性状差异外,受原始品种的基因型或基因型组合控制的基本性状的表达与原始品种 相同. ３􀆰４ 平均覆盖倍数　averagecoverage 比对到标记位点上的测序片段数目与标记位点数目的比值. [来源:GB/T３８５５１,３􀆰４] ３􀆰５ 检出的标记位点　detectedmarker 至少有一个等位基因型有２０条及以上测序片段支持的标记位点. [来源:GB/T３８５５１,３􀆰５] ４　原理 利用多重聚合酶链式反应(PCR)扩增和高通量测序,检测样品基因组上的MNP标记位点,分析测序 数据,获得标记位点的分型结果和鉴定结论. １NY/T４２３４—２０２２ ５　试剂和材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水 GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰２　多重PCR扩增与文库构建试剂盒 该试剂盒能采用附录A中所有引物进行多重PCR扩增,且构建的文库能匹配采用的高通量测序仪 品牌与型号. ５􀆰３　高通量测序试剂盒 该试剂盒能匹配所采用的高通量测序仪品牌与型号. ５􀆰４　芒果MNP标记引物 见附录A. ６　仪器设备 基因扩增仪、高通量测序仪. ７　鉴定步骤 ７􀆰１　操作要求 样品准备、DNA提取、多重PCR扩增与文库构建、高通量测序在规定的区域或相互隔离的区域按单 一方向进行操作且保持实验室洁净.不同区域的仪器设备应专用. ７􀆰２　抽样 ７􀆰２􀆰１　从芒果品种群体中抽取的个体的数量应大于３０. ７􀆰２􀆰２　样品个体类型宜为幼嫩且新鲜的叶片,也可采用其他能代表当代基因组DNA遗传物质且能提取 合格基因组DNA的组织或器官. ７􀆰２􀆰３　从芒果品种群体中的抽样应具有代表性. ７􀆰３　DNA提取 DNA提取宜根据提取试剂盒说明书进行.所用DNA提取方法应确保提取的DNA质量和浓度符合 多重PCR扩增的要求,DNA电泳主带明显,无明显降解和RNA残留,提取与纯化的DNA溶液在２６０ nm与２８０nm处的吸光度比值宜介于１􀆰８~２􀆰０,在２６０nm与２３０nm处的吸光度比值宜大于２􀆰０. ７􀆰４　多重PCR扩增与文库构建 按多重PCR扩增与文库构建试剂盒的说明书进行DNA质控、多重PCR扩增、文库构建与纯化.其 中,多重PCR的扩增循环数不建议高于２０个. ７􀆰５　高通量测序 按高通量测序试剂盒和高通量测序仪的操作说明进行高通量测序. 高通量测序的平均覆盖倍数设置为７００倍以上,测序长度大于标记引物在参考基因组上的扩增长度. ７􀆰６　测序数据质量控制 数据质量控制如下: a)　利用MLMNP品种鉴定软件(v１􀆰０及其更新版本)将样品的测序数据比对到参考基因组的标记 位点上,统计第一次检测的标记位点的平均覆盖倍数C１; b)　当C１小于５００时,判定样品的测序数据量不足,从７􀆰５或之前的步骤开始重新实验至第一次检 测的标记位点的平均覆盖倍数C１大于或等于５００; c)　当C１大于或等于５００时,进一步计算检出的标记位点的比例R１＝T１ T,其中,T１和T分别为样 品检出的标记位点的数目和检测的标记位点的数目; ２NY/T４２３４—２０２２ d)　当R１大于或等于９５％时,判定测序数据合格; e)　当R１小于９５％时,判定文库构建可能失败,从７􀆰３或之前的步骤开始重新实验至第二次检测的 标记位点的平均覆盖倍数C２大于或等于５００; f)　当C２大于或等于５００时,进一步计算第一次和第二次共同的检出的标记位点的比例R＝ ２T１２ T１＋T２,其中,T１２为第一次和第二次共同检出的标记位点的数目,T１和T２为第一次和第二 次分别检出的标记位点的数目; g)　当R２大于或等于９５％时,判定测序数据合格. ８　结果计算分析 ８􀆰１　结果计算 遗传相似度按公式(１)计算. GS＝nij Nij×１００ (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: GS———待测品种与对照品种的遗传相似度,单位为百分号(％); nij———待测品种与对照品种中均检出的但基因型无差异的标记位点的数目; Nij———待测品种与对照品种中均检出的标记位点的数目. ８􀆰２　结果判定 ８􀆰２􀆰１　原始品种的鉴定 当对照品种为待测品种植物新品种权申请日前的所有已知品种时,判定待测品种是否为原始品种. 当待测品种与所有对照品种间的遗传相似度(GS)均小于９０％时,判定待测品种为原始品种. ８􀆰２􀆰２　实质性派生品种的鉴定 当对照品种为原始品种时,判定待测品种是否为对照品种的实质性派生品种; 当GS小于９０％时,判定待测品种不是对照品种的实质性派生品种; 当GS大于或等于９０％时,判定待测品种是对照品种的实质性派生品种. ８􀆰２􀆰３　品种真实性鉴定 当GS小于９６％时,判定待测品种与对照品种为“不同品种”; 当GS大于或等于９６％且小于９９％时,判定待测品种与对照品种为“近似品种”; 当GS大于或等于９９％时,判定待测品种与对照品种为“极近似品种或相同品种”. ８􀆰２􀆰４　对“近似品种”或“极近似品种或相同品种”的样品,可按NY/T２４４０的规定进一步进行田间种植 鉴定. ３NY/T４２３４—２０２２ 附　录　A (规范性) 芒果MNP标记引物 　 表A􀆰１中提供了６５４个MNP标记位点对应的引物序列信息. 表A􀆰１　芒果MNP标记引物 序号染色体 正向引物(从５′端到３′端) 反向引物(从５′端到３′端) １chr１ TGTAGGAAACCTTGTGGAGTTCAAT AAAA