2 0 2 3 0 2 1 7 发 布 － － 2 0 2 3 0 6 0 1 － － 实 施 饲 料 中 吡 啶 甲 酸 铬 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 3 1 0 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f c h r o m i u m p i c o l i n a t e i n f e e d s — H i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３１０—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:浙江省兽药饲料监察所. 本文件主要起草人:任玉琴、吴望君、罗成江、侯轩、王彬、裘丞军、陈晓林、黄娟. ⅠNY/T４３１０—２０２３ 饲料中吡啶甲酸铬的测定　高效液相色谱法 １　范围 本文件描述了饲料中吡啶甲酸铬的高效液相色谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中吡啶甲酸铬的测定. 本文件配合饲料、浓缩饲料、精料补充料的检出限为０􀆰０５mg/kg、定量限为０􀆰１mg/kg,添加剂预混 合饲料的检出限为０􀆰１mg/kg、定量限为０􀆰５mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中的吡啶甲酸铬用乙腈提取,经浓缩净化后,用高效液相色谱仪测定,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２,一级. ５􀆰２　乙腈:色谱纯. ５􀆰３　甲醇. ５􀆰４　１０％乙腈溶液:量取１０mL乙腈,加水至１００mL,混匀. ５􀆰５　乙腈溶液饱和的正己烷:量取正己烷２００mL,加１０％乙腈溶液(５􀆰４)５０mL,混匀,静置,取上层 溶液. ５􀆰６　磷酸盐缓冲液(pH７􀆰０):称取三水合磷酸氢二钾５􀆰７g,无水磷酸二氢钾３􀆰４g,加水溶解并定容至 １０００mL,混匀. ５􀆰７　标准储备溶液(２５０μg/mL):称取吡啶甲酸铬标准品(CAS号:１４６３９Ｇ２５Ｇ９,纯度≥９８􀆰０％)２５mg (精确至０􀆰０１mg),置于１００mL容量瓶中,加乙腈(５􀆰２)超声溶解,用乙腈定容,混匀.２℃~８℃保存, 有效期６个月. ５􀆰８　标准中间溶液(２５μg/mL):准确移取标准储备溶液(５􀆰７)１０mL于１００mL容量瓶中,用水定容,摇 匀.临用现配. ５􀆰９　标准系列溶液:准确移取标准中间溶液(５􀆰８)适量,用水定容,配制成浓度分别为０􀆰０５μg/mL、 ０􀆰１μg/mL、０􀆰５μg/mL、１􀆰０μg/mL、２􀆰０μg/mL、５􀆰０μg/mL标准系列溶液.临用现配. ５􀆰１０　固相萃取柱:混合型阴离子交换柱,５００mg/６mL. ５􀆰１１　微孔滤膜:０􀆰４５μm,有机系. １NY/T４３１０—２０２３ ６　仪器设备 ６􀆰１　高效液相色谱仪:配紫外检测器或二极管阵列检测器. ６􀆰２　分析天平:精度０􀆰０１mg、０􀆰１mg和１mg. ６􀆰３　离心机:转速不低于８０００r/min. ６􀆰４　氮吹仪. ６􀆰５　超声波清洗器. ６􀆰６　涡旋混合器. ７　样品 按GB/T２０１９５制备样品,粉碎使其全部通过０􀆰４５mm孔径的分析筛,充分混匀,装入磨口瓶中, 备用. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做２份试验.称取配合饲料约５g、浓缩饲料和精料补充料３g~５g、添加剂预混合饲料约１g, 精确至０􀆰１mg,置于５０mL离心管中,加入乙腈(５􀆰２)２５mL,涡旋或超声(超声温度不超过５０℃) ２０min,８０００r/min离心１０min,取上清液,置于容量瓶中.残渣用乙腈(５􀆰２)２５mL重复提取１次,合并 ２次提取液,用乙腈(５􀆰２)定容至５０mL,混匀. ８􀆰２　浓缩、净化 ８􀆰２􀆰１　配合饲料、浓缩饲料、精料补充料 准确移取提取液(８􀆰１)５mL~５０mL(V１,相当于吡啶甲酸铬０􀆰５μg~５０μg),于５０℃下用氮气吹至 近干,加５􀆰００mL１０％乙腈溶液(５􀆰４),超声或涡旋使溶解,加乙腈溶液饱和的正己烷(５􀆰５)３mL除脂,涡 旋１０s,８０００r/min离心３min,取下层清液１􀆰００mL(V２),加３mL水,混匀,为试样溶液A.取固相萃 取柱(５􀆰１０)依次用５mL甲醇(５􀆰３)和５mL水预淋洗,取试样溶液A全部过柱,用８mL乙腈(５􀆰２)洗脱, 收集洗脱液,于５０℃下用氮气吹至近干,加２􀆰００mL(V３)１０％乙腈溶液(５􀆰４)超声或涡旋使溶解,用 ０􀆰４５μm微孔滤膜(５􀆰１１)过滤,滤液为试样溶液. ８􀆰２􀆰２　添加剂预混合饲料 准确移取提取液(８􀆰１)５mL~５０mL(V１,相当于含吡啶甲酸铬０􀆰２５μg~２５μg),置于离心管中,于 ５０℃下用氮气吹至近干,准确加入５mL１０％乙腈溶液(５􀆰４),超声或涡旋使溶解,８０００r/min离心 ５min,取上清液用０􀆰４５μm微孔滤膜(５􀆰１１)过滤,滤液为试样溶液. ８􀆰３　液相色谱参考条件 色谱柱:C１８柱,长２５０mm,内径４􀆰６mm,粒径５μm,或性能相当者; 柱温:３０℃; 检测波长:２６４nm; 流速:０􀆰８mL/min; 进样量:５０μL; 流动相:A为乙腈(５􀆰２);B为磷酸盐缓冲液(５􀆰６),梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间,min 流动相A,％ 流动相B,％ ０ ７ ９３ １５ ７ ９３ １６ ３０ ７０ ２NY/T４３１０—２０２３ 表１(续) 时间,min 流动相A,％ 流动相B,％ ２１ ３０ ７０ ２２ ７ ９３ ３０ ７ ９３ ８􀆰４　测定 ８􀆰４􀆰１　标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取标准系列溶液(５􀆰９)和试样溶液(８􀆰２􀆰１或８􀆰２􀆰２)上机测定.吡啶甲酸 铬标准溶液的液相色谱图见附录A. ８􀆰４􀆰２　定性 以保留时间定性,试样溶液中吡啶甲酸铬色谱峰的保留时间应与标准系列溶液(浓度相当)中吡啶甲 酸铬色谱峰的保留时间一致,其相对偏差应在±２􀆰５％. ８􀆰４􀆰３　定量 以吡啶甲酸铬的浓度为横坐标,色谱峰面积(响应值)为纵坐标,绘制标准曲线,其相关系数应不低于 ０􀆰９９.试样溶液中吡啶甲酸铬的浓度应在标准曲线的线性范围内.如超出范围,应将试样溶液用１０％乙 腈溶液(５􀆰４)稀释后,重新测定.单点校准定量时,试样溶液中吡啶甲酸铬的峰面积与标准溶液中吡啶甲 酸铬的峰面积相差不超过３０％. ９　试验数据处理 配合饲料、浓饲缩饲料、精料补充料试样中吡啶甲酸铬的含量以质量分数w计,数值以毫克每千克 (mg/kg)表示.多点校准按公式(１)计算,单点校准按公式(２)计算. w＝ρ×５０×５×V３×１０００ m×V１×V２×１０００(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: ρ　———从标准曲线查得的试样溶液中吡啶甲酸铬质量浓度的数值,单位为微克每毫升(μg/mL); ５０———提取液总体积的数值,单位为毫升(mL); ５———第一次氮吹后复溶体积的数值,单位为毫升(mL); V１———移取提取液体积的数值,单位为毫升(mL); V２———除脂后移取下层清液体积的数值,单位为毫升(mL); V３———第二次氮吹后复溶体积的数值,单位为毫升(mL); m———试样质量的数值,单位为克(g). w＝A×CS×５０×５×V３×１０００ AS×m×V１×V２×１０００(２) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 A　———试样溶液中吡啶甲酸铬色谱峰面积; AS———标准溶液中吡啶甲酸铬色谱峰面积; CS———标准溶液中吡啶甲酸铬质量浓度的数值,单位为微克每毫升(μg/mL); ５０———提取液总体积的数值,单位为毫升(mL); ５———第一次氮吹后复溶体积的数值,单位为毫升(mL); V１———移取提取液体积的数值,单位为毫升(mL); V２———除脂后移取下层清液体积的数值,单位为毫升(mL); V３———第二次氮吹后复溶体积的数值,单位为毫升(mL); m———试样质量的数值,单位为克(g). 添加剂预混合饲料试样中吡啶甲酸铬的含量以质量分数w计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示.多 点校准按公式(３)计算,单点校准按公式(４)计算. ３NY/T４３１０—２０２３ w＝ρ×５０×５×１０００ m×V１×１０００(３) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: ρ　———从标准曲线查得的试样溶液中吡啶甲酸铬的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); ５０———提取液总体积的数值,单位为毫升(mL); ５———氮吹后复溶体积的数值,单位为毫升(mL); V１———移取提取液体积的数值,单位为毫升