2 0 2 3 0 4 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 8 0 1 － － 实 施 浆 果 类 水 果 中 花 青 苷 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 法 3 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 0 8 0 . 1 0 C C S B 4 3 5 2 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f a t h o c y a n i n s i n b e r r y f r u i t s b y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３５２—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出. 本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口. 本文件起草单位:青岛农业大学、农业农村部果品质量安全风险评估实验室(青岛)、青岛市农产品质 量安全中心、江苏徐淮地区徐州农业科学研究所、山东农业工程学院、青岛市现代农业质量与安全工程重 点实验室. 本文件主要起草人:聂继云、万浩亮、韩令喜、张佳、姜鹏、贾东杰、孟杰、原永兵、秦旭、刘晓丽、付红蕾、 魏亦山. ⅠNY/T４３５２—２０２３ 浆果类水果中花青苷的测定　高效液相色谱法 １　范围 本文件规定了浆果类水果中花青苷测定的高效液相色谱法. 本文件适用于浆果类水果中１６种花青苷(附录A)的测定. 本文件测定的１６种花青苷中,矮牵牛素Ｇ３ＧOＧ葡萄糖苷和芍药素Ｇ３ＧOＧ葡萄糖苷的线性范围为 ０􀆰５mg/L~５０mg/L,其余１４种花青苷的线性范围为０􀆰５mg/L~１００mg/L;以试样称样量为１g、定容 体积为５０mL计,１６种花青苷的检出限和定量限详见附录A. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 浆果类水果中的花青苷经盐酸甲醇溶液振荡提取,经反相色谱柱分离,紫外－可见光检测器或二极管 阵列检测器检测,以保留时间定性,外标法定量. ５　试剂和材料 ５􀆰１　除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰２　甲醇(CH３OH). ５􀆰３　甲酸(HCOOH):色谱纯. ５􀆰４　盐酸(HCl):３６％~３８％. ５􀆰５　乙腈(CH３CN):色谱纯. ５􀆰６　盐酸甲醇溶液:６mL盐酸(５􀆰４)和１９４mL甲醇(５􀆰２)混匀. ５􀆰７　提取剂:５０mL盐酸甲醇溶液(５􀆰６)和４５０mL甲醇(５􀆰２)混匀. ５􀆰８　流动相A:５０mL甲酸(５􀆰３),用超纯水定容至１０００mL. ５􀆰９　流动相B:１０００mL乙腈(５􀆰５). ５􀆰１０　标准品:纯度≥９５％,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质,相关信息见附录A. ５􀆰１１　单标储备溶液:准确称取５􀆰０mg,用提取剂(５􀆰７)溶解并定容至５mL,即为１０００mg/L的单标储 备液,于－１８℃储存于密闭棕色玻璃瓶中,有效期６个月. ５􀆰１２　混合标准工作液:将单标储备溶液混合后,用提取剂(５􀆰７)作为溶剂,逐级稀释成０􀆰５mg/L、 ５mg/L、２０mg/L、５０mg/L、１００mg/L、１２０mg/L的花青苷混合标准溶液,现用现配.根据浆果类水果 种类,选择相应的单标储备溶液进行配制. ５􀆰１２　微孔滤膜:０􀆰４５μm,有机相. ６　仪器与设备 ６􀆰１　高效液相色谱仪:配有紫外Ｇ可见光检测器或二极管阵列检测器. １NY/T４３５２—２０２３ ６􀆰２　分析天平:感量为０􀆰０１g和０􀆰０００１g. ６􀆰３　摇床:温度可控,转速２００r/min. ６􀆰４　离心机:转速不低于５０００r/min. ６􀆰５　冷冻研磨机:转速２５０００r/min. ７　试样的制备与保存 ７􀆰１　试样制备 果实洗净,擦干,取可食部分２００g,切碎混匀,用冷冻研磨机研成粉末. ７􀆰２　试样保存 试样装入样品瓶中,密封,置－８０℃条件下冷冻保存. ８　测定步骤 ８􀆰１　提取 称取１􀆰００g试样于５０mL离心管中,加入２０mL提取剂(５􀆰７),混匀,置摇床上３０℃２００r/min振荡 提取６０min,５０００r/min离心１０min,将上清液转入５０􀆰０mL棕色容量瓶中,残渣再用２０mL提取剂 (５􀆰７)按上述步骤重复提取一次,合并上清液,用提取剂(５􀆰７)定容至５０􀆰０mL,混匀,过微孔滤膜(５􀆰１３), 待测. ８􀆰２　液相色谱参考条件 a)　色谱柱:C１８柱,２５０mm×４􀆰６mm(内径),粒径５μm,或相当者; b)　进样量:１０μL; c)　流速:１􀆰０mL/min; d)　柱温:４０℃; e)　检测波长:５２０nm; f)　梯度洗脱条件,见表１. 表１　流动相梯度洗脱程序 时间,min 流动相A,％ 流动相B,％ ０􀆰０ ９４􀆰０ ６􀆰０ ３０􀆰０ ９２􀆰０ ８􀆰０ ３１􀆰０ ９１􀆰０ ９􀆰０ ６０􀆰０ ８８􀆰０ １２􀆰０ ６１􀆰０ ０􀆰０ １００􀆰０ ７０􀆰０ ０􀆰０ １００􀆰０ ７１􀆰０ ９４􀆰０ ６􀆰０ ７５􀆰０ ９４􀆰０ ６􀆰０ ８􀆰３　标准曲线的绘制 将混合标准工作液(５􀆰１２)注入高效液相色谱仪中进行测定.以峰面积为纵坐标、标准溶液浓度为横 坐标,绘制标准曲线,求回归方程和相关系数. ８􀆰４　测定 将试样溶液(８􀆰１)注入高效液相色谱仪中进行测定.以保留时间定性,按外标法以色谱峰面积定量. 若样品溶液花青苷浓度超出了标准曲线的线性范围,应稀释后再行测定. ８􀆰５　空白试验 除不加试样外,均按照８􀆰１~８􀆰４测定步骤操作. ９　结果计算 试样中各花青苷的含量按公式(１)计算. ２NY/T４３５２—２０２３ ω＝(ρ－ρ０)×V×f m(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: ω———质量分数的数值,单位为毫克每千克(mg/kg); ρ———从标准曲线上查得的试样提取液中待测组分浓度的数值,单位为毫克每升(mg/L); ρ０———从标准曲线上查得的空白试验提取液中待测组分浓度的数值,单位为毫克每升(mg/L); V———试样提取液定容体积的数值,单位为毫升(mL); f———试样提取液稀释倍数; m———试样质量的数值,单位为克(g). 计算结果以２次测定结果的算术平均值表示,保留３位有效数字. １０　精密度 在重复性条件下获得的２次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的１０％. 在再现性条件下获得的２次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的１５％. １１　色谱图 标准溶液色谱图见附录B. ３NY/T４３５２—２０２３ 附　录　A (资料性) １６种花青苷标准物质的基本信息、检出限和定量限 　 １６种花青苷标准物质的基本信息、检出限和定量限见表A􀆰１. 表A􀆰１　１６种花青苷标准物质的基本信息、检出限和定量限 序号 名称 CAS号 分子式 检出限mg/kg定量限mg/kg １ 飞燕草素Ｇ３ＧOＧ半乳糖苷 ２８５００Ｇ００Ｇ７ C２１H２１O１２ ０􀆰１５ ０􀆰５０ ２ 飞燕草素Ｇ３ＧOＧ葡萄糖苷 ６９０６Ｇ３８Ｇ３ C２１H２１O１２ ０􀆰１０ ０􀆰３０ ３ 飞燕草素Ｇ３ＧOＧ芸香糖苷 １５６７４Ｇ５８Ｇ５ C２７H３１O１６ ０􀆰１５ ０􀆰５０ ４ 矢车菊素Ｇ３ＧOＧ葡萄糖苷 ７０８４Ｇ２４Ｇ４ C２１H２１O１１ ０􀆰０５ ０􀆰１５ ５ 矢车菊素Ｇ３ＧOＧ阿拉伯糖苷 ２７２１４Ｇ７２Ｇ８ C２０H１９O１０ ０􀆰１５ ０􀆰５０ ６ 矮牵牛素Ｇ３ＧOＧ葡萄糖苷 ６９８８Ｇ８１Ｇ４ C２２H２３O１２ ０􀆰１０ ０􀆰３０ ７ 矮牵牛素Ｇ３ＧOＧ半乳糖苷 ２８５００Ｇ０２Ｇ９ C２２H２３O１２ ０􀆰２０ ０􀆰６０ ８ 芍药素Ｇ３ＧOＧ葡萄糖苷 ６９０６Ｇ３９Ｇ４ C２２H２３O１１ ０􀆰１５ ０􀆰５０ ９ 锦葵色素Ｇ３ＧOＧ半乳糖苷 ３０１１３Ｇ３７Ｇ２ C２３H２５O１２ ０􀆰１０ ０􀆰３０ １０ 芍药素Ｇ３ＧOＧ阿拉伯糖苷 ２７２１４Ｇ７４Ｇ０ C２１H２１O１０ ０􀆰１５ ０􀆰５０ １１ 锦葵色素Ｇ３ＧOＧ葡萄糖苷 ７２２８Ｇ７８Ｇ６ C２３H２５O１２ ０􀆰１５ ０􀆰５０ １２ 锦葵色素Ｇ３ＧOＧ阿拉伯糖苷 ２８５００Ｇ０４Ｇ１ C２２H２３O１１ ０􀆰１０ ０􀆰３０ １３ 飞燕草素Ｇ３ＧOＧ５ＧOＧ二葡萄糖苷 １７６７０Ｇ０６Ｇ３ C２７H３１O１７ ０􀆰１５ ０􀆰５０ １４ 矢车菊素Ｇ３ＧOＧ５ＧOＧ二葡萄糖苷 ２６１１Ｇ６７Ｇ８ C２７H３１O１６ ０􀆰１５ ０􀆰５０ １５ 矢车菊素Ｇ３ＧOＧ半乳糖苷 ２７６６１Ｇ３６Ｇ５ C２１H２１O１１ ０􀆰１０ ０􀆰３０ １６ 天竺葵素Ｇ３ＧOＧ葡萄糖苷 １８４６６Ｇ５１Ｇ８ C２１H２１O１０ ０􀆰１５ ０􀆰５０ ４