2 0 2 3 0 4 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 8 0 1 － － 实 施 蔬 菜 中 甲 基 硒 代 半 胱 氨 酸 、 硒 代 蛋 氨 酸 和 硒 代 半 胱 氨 酸 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 3 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 0 8 0 . 2 0 C C S B 4 3 5 3 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f m e t h y l s e l e n o c y s t e i n e , s e l e n o t m e t h i o n i n e a n d s e l e n o c y s t e i n e i n v e g e t a b l e s b y l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３５３—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出. 本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口. 本文件起草单位:江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所、江西省农学会、江西省农业科学 院土壤肥料与资源环境研究所. 本文件主要起草人:廖且根、张莉、向建军、万鹏、袁丽娟、沈思言、张大文、魏益华、罗林广、戴廷灿、邱 素艳、熊艳. ⅠNY/T４３５３—２０２３ 蔬菜中甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸的测定 液相色谱Ｇ串联质谱法 １　范围 本文件规定了蔬菜中甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸含量的液相色谱Ｇ串联质谱测定 方法. 本文件适用于蔬菜中甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸含量的测定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中硒代氨基酸用蛋白酶水解提取,经超滤管离心净化,用液相色谱Ｇ串联质谱仪检测,基质匹配标 准溶液校准,外标法定量. ５　试剂和材料 ５􀆰１　除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰２　试剂 ５􀆰２􀆰１　甲醇(CH３OH):色谱纯. ５􀆰２􀆰２　甲酸(HCOOH):色谱纯. ５􀆰２􀆰３　蛋白酶(proteaseXIV,CAS号:９０３６Ｇ０６Ｇ０):酶活力≥３􀆰５U/mg. ５􀆰２􀆰４　抗坏血酸(C６H８O６,CAS号:５０Ｇ８１Ｇ７). ５􀆰２􀆰５　三羟甲基氨基甲烷(C４H１１NO３,CAS号:７７Ｇ８６Ｇ１). ５􀆰２􀆰６　盐酸(HCl),浓度为３６％~３８％. ５􀆰３　试剂配制 ５􀆰３􀆰１　蛋白酶溶液(５􀆰０mg/mL):称取蛋白酶(５􀆰２􀆰３)２５０mg,用水稀释定容至５０mL,摇匀,备用,现用 现配. ５􀆰３􀆰２　抗坏血酸溶液(０􀆰２mol/L):称取抗坏血酸(５􀆰２􀆰４)３􀆰５２g,用水稀释定容至１００mL,摇匀,备用, 现用现配. ５􀆰３􀆰３　三羟甲基氨基甲烷Ｇ盐酸(TrisＧHCl)缓冲溶液(１０􀆰０mmol/L,pH７􀆰５):称取０􀆰６０６g三羟甲基氨 基甲烷(５􀆰２􀆰５)溶于４５０mL水中,用盐酸(５􀆰２􀆰６)调节到pH７􀆰５,加水稀释至５００mL,摇匀,备用. ５􀆰３􀆰４　甲酸溶液(０􀆰１％):量取甲酸(５􀆰２􀆰２)０􀆰１mL,用水稀释定容至１００mL,摇匀,备用. ５􀆰４　标准品 ５􀆰４􀆰１　甲基硒代半胱氨酸(C４H９NO２Se,CAS号:２６０４６Ｇ９０Ｇ２):纯度≥９８％,或经国家认证并授予标准物 １NY/T４３５３—２０２３ 质证书的标准物质. ５􀆰４􀆰２　硒代蛋氨酸(C５H１１NO２Se,CAS号:１４６４Ｇ４２Ｇ２):纯度≥９８％,或经国家认证并授予标准物质证书 的标准物质. ５􀆰４􀆰３　硒代半胱氨酸(C３H７NO２Se,CAS号:１０２３６Ｇ５８Ｇ５):纯度≥９５％,或经国家认证并授予标准物质证 书的标准物质. ５􀆰５　标准溶液配制 ５􀆰５􀆰１　甲基硒代半胱氨酸标准储备溶液(１０００mg/L,按Se计):取甲基硒代半胱氨酸(５􀆰３􀆰２)标准品 ２３􀆰１mg(精确至０􀆰０１mg),置于１０mL容量瓶中,用水溶解并定容.于０℃~４℃冷藏保存,有效期为１ 个月. ５􀆰５􀆰２　硒代蛋氨酸标准储备溶液(１０００mg/L,按Se计):取硒代蛋氨酸(５􀆰４􀆰２)标准品２４􀆰８mg(精确至 ０􀆰０１mg),置于１０mL容量瓶中,用水溶解并定容.于０℃~４℃冷藏保存,有效期为１个月. ５􀆰５􀆰３　硒代半胱氨酸标准储备溶液(１０００mg/L,按Se计):取硒代半胱氨酸标准品(５􀆰４􀆰３)２１􀆰２mg(精 确至０􀆰０１mg),置于１０mL容量瓶中,用０􀆰５mL甲酸(５􀆰２􀆰２)溶解后,用水溶解并定容.于０℃~４℃冷 藏保存,有效期为１个月. ５􀆰５􀆰４　混合标准工作溶液(１􀆰０mg/L,按Se计):分别量取０􀆰０５mL标准储备溶液(５􀆰５􀆰１,５􀆰５􀆰２,５􀆰５􀆰３) 于５０mL容量瓶中,用水稀释并定容至５０mL,现用现配. ５􀆰６　材料 ５􀆰６􀆰１　微孔滤膜:水相,０􀆰２２μm. ５􀆰６􀆰２　超滤离心管:１５mL/３ku,或性能相当者. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱Ｇ串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI). ６􀆰２　分析天平:感量０􀆰００００１g和０􀆰０１g. ６􀆰３　pH计,精度０􀆰１. ６􀆰４　涡旋混合仪. ６􀆰５　恒温水浴振荡器. ６􀆰６　高速离心机,转速不低于１２０００r/min. ６􀆰７　组织捣碎机. ７　试验步骤 ７􀆰１　试样的制备 将蔬菜样品可食部分经组织捣碎均分成２份,装入洁净容器内,作为试样密封并标明标记. ７􀆰２　试样提取与净化 称取试样２g(精确至０􀆰０１g),置于５０mL离心管中,依次加入蛋白酶溶液(５􀆰３􀆰１)２􀆰０mL、抗坏血酸 溶液(５􀆰３􀆰２)０􀆰２５mL和TrisＧHCL缓冲溶液(５􀆰３􀆰３)７􀆰７５mL,涡旋混匀,于恒温水浴振荡器上３７℃条件 下振荡提取１２h,１２０００r/min离心１０min.提取液经０􀆰２２μm滤膜过滤转移至１５mL离心管中,再将 过滤后５􀆰０mL提取液转移至超滤离心管(５􀆰６􀆰２)中,４０００r/min离心１０min,取０􀆰１mL超滤液加入 ０􀆰９mL甲酸溶液(５􀆰３􀆰４),混匀待测. ７􀆰３　标准曲线绘制 取空白试样,按７􀆰２处理得到超滤溶液,准确量取０􀆰１mL,分别准确移取适量混合标准工作溶液 (５􀆰５􀆰４),用甲酸溶液(５􀆰３􀆰４)稀释定容至１􀆰０mL,配制成浓度为０􀆰２ng/mL、０􀆰５ng/mL、１􀆰０ng/mL、 ２􀆰０ng/mL、５􀆰０ng/mL和１０􀆰０ng/mL基质匹配标准系列溶液,液相色谱－串联质谱仪测定.以待测物 特征离子质量色谱图峰面积为纵坐标、对应浓度为横坐标绘制标准曲线. ２NY/T４３５３—２０２３ ７􀆰４　测定 ７􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 a)　色谱柱:C１８柱,３􀆰０mm×１００mm,粒径１􀆰８μm,或性能相当者; b)　进样量:１０􀆰０μL; c)　流速:０􀆰２mL/min; d)　柱温:３５℃; e)　流动相:A为０􀆰１％甲酸水溶液(５􀆰３􀆰４);B为甲醇(５􀆰２􀆰１),梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间,min A,％ B,％ ０􀆰０ １００ ０ ３􀆰５ ８０ ２０ ４􀆰５ ０ １００ ５􀆰０ ０ １００ ５􀆰１ １００ ０ ６􀆰０ １００ ０ ７􀆰４􀆰２　质谱参考条件 a)　离子源:电喷雾离子源; b)　扫描方式:正离子扫描; c)　检测方式:多反应监测; d)　喷雾电压、离子源温度、脱溶剂温度和氮气流速等参数应优化至最优灵敏度; e)　定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表２. 表２　定性离子对、定量离子对和碰撞能量 化合物名称 定性离子对,碰撞能量(m/z,eV) 定量离子对,碰撞能量(m/z,eV) 甲基硒代半胱氨酸１６６􀆰９/９５(２５) １６６􀆰９/５５􀆰２(１８)１６６􀆰９/９５(２５) 硒代蛋氨酸１９８/１８０􀆰８(８) １９８/５６􀆰２(２０)１９８/５６􀆰２(２０) 硒代半胱氨酸１６８/１３９􀆰９(８) １６８/７４􀆰１(１５)１６８/７４􀆰１(１５) ７􀆰４􀆰３　定性测定 在同样测试条件下,试样溶液中甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸的保留时间与基质匹 配标准工作液中甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的保留时间相对偏差在±２􀆰５％以内,且检 测到的离子的相对丰度,其允许偏差应符合表３的要求. 表３　定性确证时相对离子丰度的允许相对偏差 相对离子丰度,％ ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 允许相对偏差,％ ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ７􀆰４􀆰４　定量测定 取试样溶液和相应的基质匹配标准溶液,作单点或多点校准,按峰面积定量,基质匹配标准溶液及试