2 0 2 3 0 4 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 8 0 1 － － 实 施 禽 蛋 中 卵 磷 脂 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 3 5 4 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e i n e g g s b y h i g h p e r f o r m a n c e — l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３５４—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出. 本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口. 本文件起草单位:江苏省家禽科学研究所、农业农村部家禽品质监督检验测试中心(扬州)、谱尼测试 集团江苏有限公司. 本文件主要起草人:葛庆联、唐修君、马丽娜、高玉时、刘茵茵、陆俊贤、樊艳凤、贾晓旭、陈大伟、张静、 周倩、施祖灏、唐梦君、张小燕、黄胜海、马尹鹏. ⅠNY/T４３５４—２０２３ 禽蛋中卵磷脂的测定　高效液相色谱法 １　范围 本文件规定了禽蛋中卵磷脂[LＧαＧ磷脂酰胆碱(PC)]的高效液相色谱测定方法. 本文件适用于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹌鹑蛋等禽蛋. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样经正相色谱柱分离,蒸发光散射检测器检测,保留时间定性,外标法定量. ５　试剂和材料 ５􀆰１　试剂 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１􀆰１　水:GB/T６６８２,一级. ５􀆰１􀆰２　乙醚(C４H１０O). ５􀆰１􀆰３　无水乙醇(C２H６O). ５􀆰１􀆰４　三氯甲烷(CHCl３):色谱纯. ５􀆰１􀆰５　甲醇(CH４O):色谱纯. ５􀆰１􀆰６　正己烷(C６H１４):色谱纯. ５􀆰１􀆰７　异丙醇(C３H８O):色谱纯. ５􀆰１􀆰８　乙酸(C２H４O２):色谱纯. ５􀆰１􀆰９　三乙胺(C６H１５N):色谱纯. ５􀆰２　溶液配制 ５􀆰２􀆰１　三氯甲烷∶甲醇溶液(２∶１):分别量取２００mL三氯甲烷(５􀆰１􀆰４)和１００mL甲醇(５􀆰１􀆰５)置于同 一棕色试剂瓶中,混匀. ５􀆰２􀆰２　乙醚∶无水乙醇溶液(１∶１):分别量取５００mL乙醚(５􀆰１􀆰２)和５００mL无水乙醇(５􀆰１􀆰３)置于同 一棕色试剂瓶中,混匀. ５􀆰３　标准品 LＧαＧ磷脂酰胆碱(C４２H８０NO８P,CAS号:８００２Ｇ４３Ｇ５):含量≥９９％,或经国家认证并授予标准物质证书 的标准物质. ５􀆰４　标准溶液的制备 ５􀆰４􀆰１　LＧαＧ磷脂酰胆碱标准储备液:称取４０mg(精确至０􀆰０１mg)LＧαＧ磷脂酰胆碱置于１０mL棕色容量 １NY/T４３５４—２０２３ 瓶中,用三氯甲烷∶甲醇溶液(５􀆰２􀆰１)溶解并定容至刻度,配制成浓度为４􀆰０mg/mL的LＧαＧ磷脂酰胆碱 标准储备液,－１８℃以下冷冻保存,有效期６个月. ５􀆰４􀆰２　LＧαＧ磷脂酰胆碱标准工作溶液:量取标准储备液(５􀆰４􀆰１)２５μL、１２５μL、２５０μL、３７５μL和 ５００μL,用三氯甲烷∶甲醇溶液(５􀆰２􀆰１)稀释至１mL,配制成０􀆰１mg/mL、０􀆰５mg/mL、１􀆰０mg/mL、 １􀆰５mg/mL、２􀆰０mg/mL系列标准工作溶液. ６　仪器和设备 ６􀆰１　高效液相色谱仪:配有蒸发光散射检测器. ６􀆰２　天平:感量为１mg和０􀆰０１mg. ６􀆰３　匀浆机:转速６５００r/min~２２０００r/min. ６􀆰４　涡旋混匀器:转速３０００r/min. ６􀆰５　离心机:转速１００００r/min. ６􀆰６　氮吹仪. ６􀆰７　滤膜:孔径０􀆰２２μm. ７　试样的制备与保存 ７􀆰１　试样的制备 ７􀆰１􀆰１　取６枚~１０枚供试禽蛋,去壳,并使均质,总质量不少于２００g,作为全蛋试样. ７􀆰１􀆰２　取６枚~１０枚供试禽蛋,去壳和蛋清,用滤纸吸干蛋黄表面的蛋清,并使均质,总质量不少于 ２００g,作为蛋黄试样. ７􀆰２　试样的保存 －１８℃以下保存. ８　测定步骤 ８􀆰１　提取 称取１􀆰０g全蛋试样(７􀆰１􀆰１)或０􀆰５g蛋黄试样(７􀆰１􀆰２)(精确到０􀆰００１g),于５０mL离心管中,加入 １５mL乙醚∶无水乙醇溶液(５􀆰２􀆰２),涡旋振荡５min,１００００r/min离心５min,上清液转入另一５０mL 离心管中,重复提取１次,合并２次上清液,４０℃氮气吹干,用三氯甲烷∶甲醇溶液(５􀆰２􀆰１)溶解并定容至 ２０mL,过０􀆰２２μm滤膜,供高效液相色谱测定. ８􀆰２　液相色谱参考条件 ８􀆰２􀆰１　色谱柱:SiO２(４􀆰０mm×１５０mm,４μm),或相当者. ８􀆰２􀆰２　流动相:A为甲醇(５􀆰１􀆰５)∶水∶乙酸(５􀆰１􀆰８)∶三乙胺(５􀆰１􀆰９)＝８５∶１５∶０􀆰４５∶０􀆰０５,B为正 己烷(５􀆰１􀆰６)∶异丙醇(５􀆰１􀆰７)∶流动相A＝２０∶４８∶３２. ８􀆰２􀆰３　流速:１􀆰０mL/min. ８􀆰２􀆰４　进样量:２０μL. ８􀆰２􀆰５　柱温:３０℃. ８􀆰２􀆰６　蒸发光散射检测器参数:漂移管温度为５０℃,载气流量为１􀆰８L/min. ８􀆰２􀆰７　流动相梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间,min A,％ B,％ ０ ０ １００ ５􀆰０ ０ １００ ２NY/T４３５４—２０２３ 表１(续) 时间,min A,％ B,％ １０􀆰０ ３０ ７０ １４􀆰０ ６７ ３３ １４􀆰１ ０ １００ １６􀆰０ ０ １００ ８􀆰３　标准曲线的制作 分别取系列标准工作溶液(５􀆰４􀆰２)上机测定,以LＧαＧ磷脂酰胆碱标准工作溶液浓度的对数为横坐标,对 应的峰面积的对数为纵坐标,绘制标准工作曲线.LＧαＧ磷脂酰胆碱标准溶液的高效液相色谱图见附录A. ８􀆰４　测定 取试样溶液上机测定,并作多点校准.以保留时间定性,色谱峰面积定量,按外标法计算. ９　结果计算 试样中LＧαＧ磷脂酰胆碱含量以质量分数X计,按公式(１)计算. X＝ρ×V m×１０００×１００ (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: X———试样中LＧαＧ磷脂酰胆碱含量的数值,单位为克每百克(g/１００g); ρ———由标准工作曲线得到试样溶液中LＧαＧ磷脂酰胆碱质量浓度的数值,单位为毫克每毫升(mg/ mL); V———试样溶液定容体积的数值,单位为毫升(mL); m———试样质量的数值,单位为克(g). 计算结果表示到小数点后２位. １０　精密度 在重复性条件下获得的２次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％. １１　其他 本方法蛋黄中检出限为０􀆰２０g/１００g,定量限为０􀆰４３g/１００g;全蛋中检出限为０􀆰１０g/１００g,定量限 为０􀆰２２g/１００g. ３NY/T４３５４—２０２３ 附　录　A (资料性) LＧαＧ磷脂酰胆碱标准溶液高效液相色谱图 　 LＧαＧ磷脂酰胆碱标准溶液高效液相色谱图见图A􀆰１. 图A􀆰１　LＧαＧ磷脂酰胆碱标准溶液高效液相色谱图(１􀆰０mg/mL) ４