2 0 2 3 0 4 1 1 发 布 － － 2 0 2 3 0 8 0 1 － － 实 施 饲 料 添 加 剂 角 蛋 白 酶 活 力 的 测 定 分 光 光 度 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 3 6 2 — 2 0 2 3 F e e d a d d i t i v e s — D e t e r m i n a t i o n o f k e r a t i n a s e a c t i v i t y — S p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４３６２—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院饲料研究所、山东隆科特酶制剂有限公司、福建傲农生物科技集团 股份有限公司、广州立达尔生物科技股份有限公司. 本文件主要起草人:丁宏标、钱娟娟、侯玉煌、周盛昌、陶正国、李习龙、刘胜利. ⅠNY/T４３６２—２０２３ 饲料添加剂　角蛋白酶活力的测定 分光光度法 １　范围 本文件描述了饲料添加剂角蛋白酶活力的分光光度测定方法. 本文件适用于饲料添加剂角蛋白酶产品中酶活力的测定. 本文件的方法定量限为１００U/g(U/mL). ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB５００９􀆰５—２００６　食品安全国家标准　食品中蛋白质的测定 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 角蛋白酶　keratinase 产自地衣芽孢杆菌,可以降解羽毛等动植物角蛋白生成氨基酸或肽类的蛋白酶. ３􀆰２　 角蛋白酶活力单位　keratinaseactivityunit 在４０℃、pH８􀆰０的条件下,水解酪蛋白,每分钟产生１μg的酪氨酸的酶量为一个酶活力单位. 注:单位为U. ４　原理 在一定的温度和pH条件下,角蛋白酶水解酪蛋白底物产生含有酚基和吲哚基的氨基酸,用三氯乙酸 沉淀后,在碱性条件下,将福林试剂还原,生成磷钨钼酸,在６８０nm有最大吸收,其颜色的深浅与酚基氨 基酸含量成正比.采用分光光度法测定反应液吸光值,计算角蛋白酶活力. ５　试剂或材料 除非另有说明,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２,三级. ５􀆰２　碳酸钠溶液(０􀆰４mol/L):称取无水碳酸钠(Na２CO３)４２􀆰４g,用水溶解并定容至１０００mL,混匀. ５􀆰３　三氯乙酸溶液(０􀆰４mol/L):称取三氯乙酸６５􀆰４g,用水溶解并定容至１０００mL,混匀. ５􀆰４　盐酸溶液(１mol/L):取浓盐酸８５mL,加水稀释并定容至１０００mL,混匀. ５􀆰５　盐酸溶液(０􀆰１mol/L):取１０mL１mol/L盐酸溶液(５􀆰４),定容至１００mL,混匀. ５􀆰６　氢氧化钠溶液(０􀆰５mol/L):取氢氧化钠２０􀆰０g,用水溶解,冷却至室温后定容至１０００mL,混匀. ５􀆰７　福林(Folin)试剂:于２０００mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na２WO４􀅰２H２O)１００􀆰０g、钼酸钠 (Na２MoO４􀅰２H２O)２５􀆰０g、水７００mL、８５％磷酸５０mL、浓盐酸１００mL.小火沸腾回流１０h,取下回流 １NY/T４３６２—２０２３ 冷却器,在通风橱中加入硫酸锂５０g、水５０mL和数滴浓溴水(９９％),再微沸１５min,以除去多余的溴(冷 却后仍有绿色需再加溴水,再煮沸除去过量的溴),冷却后加水定容至１０００mL.混匀、过滤.试剂应呈 金黄色,储存于棕色瓶内.或购买市售的福林试剂. ５􀆰８　福林工作溶液:以１份福林试剂与２份水混匀. ５􀆰９　硼酸钠溶液:称取３􀆰８０g硼酸钠(硼砂),加水溶解并定容至１０００mL,混匀. ５􀆰１０　硼酸溶液:称取１２􀆰３７g硼酸,加水溶解并定容至１０００mL,混匀. ５􀆰１１　硼酸缓冲溶液(pH８􀆰０):取５０mL硼酸钠溶液(５􀆰９),用硼酸溶液(５􀆰１０)将pH调至８􀆰０±０􀆰０５, 备用. ５􀆰１２　１􀆰０％酪蛋白溶液(pH８􀆰０):准确称取酪蛋白(CAS号:６０Ｇ１８Ｇ４,上海国药６９００６２２７或阿拉丁 C１１０５００１))１g,精确至０􀆰００１g,先用少量０􀆰５mL氢氧化钠溶液(５􀆰６)湿润后,再加入pH８􀆰０硼酸缓冲溶 液(５􀆰１１)约８０mL,在沸水浴中或磁力搅拌器上边加热边搅拌直至完全溶解.冷却后,用０􀆰１mol/L盐酸 溶液(５􀆰５)或０􀆰５mol/L氢氧化钠溶液(５􀆰６),将pH调至８􀆰０±０􀆰０５,并转入１００mL容量瓶中,用pH ８􀆰０硼酸缓冲溶液(５􀆰１１)定容至刻度.２℃~８℃储存,有效期为３d. １)　上海国药６９００６２２７或阿拉丁C１１０５００是商品名,给出这一信息是为了给本文件的使用者一个相对标准,并不表示对该产品的认 可.如果其他产品能有相同的效果,则可使用这些等效的产品.５􀆰１３　LＧ酪氨酸标准储备溶液(１mg/mL):准确称取预先于１０５℃干燥４h烘至恒重的LＧ酪氨酸标准物 质(CAS号:６０Ｇ１８Ｇ４,纯度≥９９％)０􀆰１g,精确至０􀆰０００１g,用２０mL１mol/L盐酸溶液(５􀆰４)溶解后,再用 水定容至１００mL,混匀.２℃~８℃储存,有效期为３d. ５􀆰１４　LＧ酪氨酸标准工作溶液(１００μg/mL):准确吸取１０mL１mg/mLLＧ酪氨酸标准储备溶液(５􀆰１３), 用０􀆰１mol/L盐酸溶液(５􀆰５)定容至１００mL,混匀.临用现配. ５􀆰１５　LＧ酪氨酸标准系列溶液:分别准确吸取０mL、１mL、２mL、３mL、４mL、５mL、６mL的LＧ酪氨酸标 准工作溶液(５􀆰１４)于试管中,依次准确加入１０mL、９mL、８mL、７mL、６mL、５mL、４mL的水,配制成浓 度分别为０μg/mL、１０μg/mL、２０μg/mL、３０μg/mL、４０μg/mL、５０μg/mL、６０μg/mL的LＧ酪氨酸标准 系列溶液.临用现配. ６　仪器设备 ６􀆰１　分光光度计:波长范围为３５０nm~８００nm,精度为±２nm. ６􀆰２　pH计:精度为±０􀆰０１. ６􀆰３　天平:精度为０􀆰０００１g和０􀆰０１g. ６􀆰４　水浴锅:精度为±０􀆰２℃. ７　样品 按照GB/T２０１９５的规定制备样品,至少２００g(或２００mL),固态样品粉碎使其全部通过０􀆰４２mm 孔径的分析筛.充分混匀,装入磨口瓶中,密闭保存,备用. ８　试验步骤 ８􀆰１　角蛋白酶鉴别 角蛋白酶鉴别试验应符合附录A的规定. ８􀆰２　试样溶液的制备 ８􀆰２􀆰１　固态试样的制备 平行做２份试验.准确称取试样１g,精确至０􀆰０００１g.准确加入硼酸缓冲溶液(５􀆰１１)１００mL, (２５±５)℃磁力搅拌提取３０min,摇匀,静置５min后,取适量上清液,用硼酸缓冲液(５􀆰１１)稀释,使稀释后 的待测酶液中角蛋白酶活力控制在１０U/mL~１５U/mL. ２NY/T４３６２—２０２３ ８􀆰２􀆰２　液态试样的制备 平行做２份试验.准确吸取试样１mL,用硼酸缓冲溶液(５􀆰１１)定容至１００mL,摇匀.吸取适量溶液 用硼酸缓冲溶液(５􀆰１１)稀释,稀释后的待测酶液中角蛋白酶活力控制在１０U/mL~１５U/mL. ８􀆰３　LＧ酪氨酸标准曲线的绘制 分别准确吸取LＧ酪氨酸标准系列溶液(５􀆰１５)各１mL,于具塞试管中(每个浓度做２个平行),分别加 入５􀆰０mL碳酸钠溶液(５􀆰２)和１􀆰０mL福林工作溶液(５􀆰８),摇匀.置于(４０±０􀆰２)℃水浴中显色２０min, 取出,置于冷水中,迅速冷却至室温,用１０mm比色皿,以不含酪氨酸的０管为空白,在分光光度计波长 ６８０nm处分别测定其吸光度.以吸光度为横坐标、LＧ酪氨酸浓度为纵坐标绘制标准工作曲线,标准曲线 的相关系数R２不低于０􀆰９９. 利用标准曲线,计算出当吸光度为１时的LＧ酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值.K值应在９５~ １０５范围内;反之,需重新配制试剂,进行试验. 注:LＧ酪氨酸标准稀释溶液应在配制后立即进行测定. ８􀆰４　试样溶液测定 ８􀆰４􀆰１　试样空白溶液的测定 吸取１􀆰００mL稀释好的酶液(８􀆰２)置于１０mL试管中,(４０±０􀆰２)℃水浴２min.加入２􀆰００mL三氯 乙酸溶液(５􀆰３),混匀,(４０±０􀆰２)℃保温１０min.加入１􀆰００mL预热的酪蛋白溶液(５􀆰１２),混匀. ８􀆰４􀆰２　试样溶液的测定 吸取１􀆰００mL稀释好的酶液(８􀆰２)置于１０mL试管中,(４０±０􀆰２)℃水浴２min.加入１􀆰００mL预热 的酪蛋白溶液(５􀆰１２),混匀,(４０±０􀆰２)℃保温１０min.加入２􀆰００mL三氯乙酸溶液(５􀆰３),混匀. ８􀆰４􀆰３　显色反应 将混匀后的试样空白溶液(８􀆰４􀆰１)与试样溶液(８􀆰４􀆰２)分别置于室温下静置１０min,用滤纸过滤.分