2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 － － 2 0 2 4 0 5 0 1 － － 实 施 苏 云 金 杆 菌 母 药 2 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 0 0 . 1 0 C C S G 4 4 0 7 — 2 0 2 3 B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s t e c h n i c a l c o n c e n t r a t e s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 H G / T 3 6 1 6 — 1 9 9 9NY/T４４０７—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替HG/T３６１６—１９９９«苏云金杆菌原粉»,与HG/T３６１６—１９９９相比,除结构调整和编辑性 改动外,主要技术变化如下: ———更改了苏云金杆菌母药毒力效价指标,由原标准的分等分级变为统一规定(见４􀆰２,HG/T ３６１６—１９９９的３􀆰２); ———增加了苏云金杆菌母药毒力效价测定用试验虫的种类和说明(见４􀆰２); ———更改了苏云金杆菌母药中毒素蛋白质量分数,由原标准的分等分级变为统一规定(见４􀆰２,HG/ T３６１６—１９９９的３􀆰２); ———更改了苏云金杆菌母药的pH指标(见４􀆰２,HG/T３６１６—１９９９的３􀆰２); ———删除了苏云金杆菌母药的湿筛试验指标(见４􀆰２,HG/T３６１６—１９９９的３􀆰２); ———增加了检验规则(见第六章); ———更改了苏云金杆菌母药的质量保证期的规定(见７􀆰２,HG/T３６１６—１９９９的６􀆰５); ———更改了苏云金杆菌母药毒力效价测定的仲裁法(见附录C,HG/T３６１６—１９９９的附录B). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出. 本文件由全国农药标准化技术委员会(SAC/TC１３３)归口. 本文件起草单位:武汉科诺生物科技股份有限公司、沈阳沈化院测试技术有限公司、湖北省生物农药 工程研究中心、福建绿安生物农药有限公司、沈阳化工研究院有限公司. 本文件主要起草人:杨闻翰、刘荷梅、于海博、王月莹、姚荣英、王婉秋、刘华梅、张志刚. 本文件所代替文件的历次版本发布情况为: ———１９９９年首次发布为HG/T３６１６—１９９９; ———本次为首次修订. ⅠNY/T４４０７—２０２３ 苏云金杆菌母药 １　范围 本文件规定了苏云金杆菌母药的技术要求、试验方法、检验规则、验收和质量保证期以及标志、标签、 包装、储运. 本文件适用于苏云金杆菌鲇泽亚种(B􀆰t􀆰a)和苏云金杆菌库斯塔克亚种(B􀆰t􀆰k)母药产品生产的质 量控制. 注:苏云金杆菌的其他名称、分类地位和形态学特征等描述见附录A. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T１６００—２０２１　农药水分测定方法 GB/T１６０１　农药pH值的测定方法 GB/T１６０４　商品农药验收规则 GB/T１６０５—２００１　商品农药采样方法 GB３７９６　农药包装通则 GB/T８１７０—２００８　数值修约规则与极限数值的表示和判定 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 毒素蛋白　toxinprotein 苏云金杆菌在芽孢形成时期产生的一种伴孢晶体蛋白,是使其产品具有杀虫活性的主要物质. ３􀆰２ 毒力效价　toxicitypotency 根据产品的生物活性和对生物体的作用来设计试验,与具有确定国际单位的标样进行对比性生物反 应,测定样品的毒力效果的生物学活性指标,其结果用单位质量的国际单位表示. ４　技术要求 ４􀆰１　外观 灰白色至棕褐色粉末. ４􀆰２　技术指标 苏云金杆菌母药还应符合表１的要求. 表１　苏云金杆菌母药技术指标 项目 指标 毒素蛋白质量分数,％ ≥７􀆰０ 毒力效价(H􀆰a􀆰)a,(IU/mg) ≥５００００ pH ４􀆰０~７􀆰０ １NY/T４４０７—２０２３ 表１(续) 项目 指标 水分,％ ≤６􀆰０ 　　a　H􀆰a􀆰代表棉铃虫(Helicoverpaarmigera),也可选择小菜蛾和甜菜夜蛾作为试验虫,试验结果分别表示为毒力效价 (P􀆰x􀆰)和毒力效价(S􀆰e􀆰),但应以毒力效价(H􀆰a􀆰)作为仲裁法.P􀆰x􀆰代表小菜蛾(Plutellaxylostella),S􀆰e􀆰代 表甜菜夜蛾(Spodopteraexigua). ５　试验方法 警示:使用本文件的人员应有实验室工作的实践经验.本文件并未指出所有的安全问题.使用者有责任采取适当的 安全和健康措施. ５􀆰１　一般规定 本文件所用试剂和水在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和蒸馏水. ５􀆰２　取样 按GB/T１６０５—２００１中５􀆰３􀆰１的规定执行.用随机数表法确定取样的包装件;最终取样量应不少于 １００g. ５􀆰３　鉴别试验 ５􀆰３􀆰１　十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDSＧPAGE) 本鉴别试验可与毒素蛋白质量分数的测定同时进行.在相同的操作条件下,试样溶液与标样溶液应 具有相同的蛋白区带,由此证明产品中的有效毒素蛋白的相对分子质量为１３００００. ５􀆰３􀆰２　生物测定法 根据代表菌株的形态学和生理生化特征进行菌种鉴别,并可辅助脂肪酸分析、Biolog、１６SrRNA序列 分析等手段.当对鉴别结果有争议或需要进行法律仲裁检验时,应到具有菌种鉴定资质的单位,将待检菌 株与模式菌种进行比对,出具菌种鉴定报告,作为仲裁依据. 有效成分的特征见附录A. ５􀆰４　外观的测定 采用目测法测定. ５􀆰５　毒素蛋白质量分数的测定 ５􀆰５􀆰１　方法提要 用碱性溶液处理苏云金杆菌母药伴孢晶体,使其降解为毒素蛋白,然后通过SDSＧPAGE,依据蛋白质 相对分子质量的差异,使毒素蛋白与其他杂蛋白分离,之后用电泳凝胶成像系统扫描蛋白区带面积,进行 定量. ５􀆰５􀆰２　试剂和溶液 ５􀆰５􀆰２􀆰１　水. ５􀆰５􀆰２􀆰２　十二烷基硫酸钠. ５􀆰５􀆰２􀆰３　三羟基甲基氨基甲烷. ５􀆰５􀆰２􀆰４　浓盐酸. ５􀆰５􀆰２􀆰５　氢氧化钠. ５􀆰５􀆰２􀆰６　甘氨酸. ５􀆰５􀆰２􀆰７　甘油. ５􀆰５􀆰２􀆰８　巯基乙醇. ５􀆰５􀆰２􀆰９　溴酚蓝. ５􀆰５􀆰２􀆰１０　考马斯亮蓝RＧ２５０. ２NY/T４４０７—２０２３ ５􀆰５􀆰２􀆰１１　甲醇. ５􀆰５􀆰２􀆰１２　冰乙酸. ５􀆰５􀆰２􀆰１３　无水乙醇. ５􀆰５􀆰２􀆰１４　０􀆰５５mol/L氢氧化钠溶液:在烧杯中量取１００mL水,缓慢加入２􀆰２g氢氧化钠,边加入边搅 拌溶解,待充分溶解后,放置室温,密闭保存备用. ５􀆰５􀆰２􀆰１５　１mol/L、pH６􀆰８三羟基甲基氨基甲烷Ｇ盐酸缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷１２􀆰１g溶于水 中,用浓盐酸调至pH６􀆰８,用水定容至１００mL. ５􀆰５􀆰２􀆰１６　电泳缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷３􀆰０g、甘氨酸１４􀆰４g、十二烷基硫酸钠１g,用水溶解并 定容至１０００mL. ５􀆰５􀆰２􀆰１７　３×样品稀释液:１mol/L、pH６􀆰８三羟基甲基氨基甲烷Ｇ盐酸缓冲液１８􀆰８mL,十二烷基硫酸 钠６g,甘油３０mL,巯基乙醇１５mL,溴酚蓝０􀆰５g,用水定容至１００mL,于－２０℃储存备用. ５􀆰５􀆰２􀆰１８　染色液:称取考马斯亮蓝RＧ２５０１􀆰０g,加入甲醇４５０mL、冰乙酸１００mL、水４５０mL,溶解过 滤后使用. ５􀆰５􀆰２􀆰１９　脱色液:量取甲醇１００mL、冰乙酸３５mL,用水定容至１０００mL. ５􀆰５􀆰２􀆰２０　漂洗液:量取无水乙醇３０mL、冰乙酸１０mL、水６０mL,混合均匀后使用. ５􀆰５􀆰２􀆰２１　固定液:量取冰乙酸７５mL,用水定容至１０００mL,混合均匀后使用. ５􀆰５􀆰２􀆰２２　毒素蛋白(相对分子质量为１３００００)标样:已知质量分数,ω≥９􀆰０％. ５􀆰５􀆰３　仪器 ５􀆰５􀆰３􀆰１　电泳仪. ５􀆰５􀆰３􀆰２　夹芯式垂直电泳槽(１􀆰０mm凹形带槽橡胶模框)、凝胶板(１􀆰０mm,１５孔或１０孔样品槽模具). ５􀆰５􀆰３􀆰３　电泳凝胶成像系统. ５􀆰５􀆰３􀆰４　水浴锅. ５􀆰５􀆰３􀆰５　可调移液器. ５􀆰５􀆰３􀆰６　微量进样器. ５􀆰５􀆰３􀆰７　离心机:２００００r/min. ５􀆰５􀆰３􀆰８　脱色摇床:９０r/min. ５􀆰５􀆰４　测定步骤 ５􀆰５􀆰４􀆰１　试样处理 分别称取含毒素蛋白５􀆰５mg的标样和试样(精确至０􀆰１mg)于１０mL离心管中,加５mL水,充分混 匀,移取０􀆰５mL至１􀆰５mL离心管中,加入０􀆰５５mol/L氢氧化钠溶液０􀆰１２５mL(使氢氧化钠溶液的最终 浓度为０􀆰１mol/L),摇匀,静置５min,再加入３×样品稀释液０􀆰３２５mL,于沸水浴中煮６min,冷却至室 温,１５０００r/min离心５min,取上层清液,以备电泳上样,样品的折算的最终定容体积为９􀆰５mL. ５􀆰５􀆰４􀆰２　SDSＧPAGE分离毒素蛋白 ５􀆰５􀆰４􀆰２􀆰１　制备８％~１０％聚丙烯酰胺凝胶 采用不连续缓冲系统,制胶方法见附录B. ５􀆰５􀆰４􀆰２􀆰２　上样 取上述标样溶解液上层清液,于聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中分别上样２μL、４μL、６μL、８μL、１０