2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 － － 2 0 2 4 0 5 0 1 － － 实 施 苏 云 金 杆 菌 悬 浮 剂 2 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 0 0 . 1 0 C C S G 4 4 0 8 — 2 0 2 3 B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s s u s p e n s i o n c o n c e n t r a t e Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 H G / T 3 6 1 8 — 1 9 9 9NY/T４４０８—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替HG/T３６１８—１９９９«苏云金杆菌悬浮剂»,与HG/T３６１８—１９９９相比,除结构调整和编辑 性改动外,主要技术变化如下: ———更改了苏云金杆菌悬浮剂毒力效价指标(见４􀆰２,HG/T３６１８—１９９９的３􀆰２); ———增加了苏云金杆菌悬浮剂毒力效价测定用试验虫的种类和说明(见４􀆰２); ———更改了苏云金杆菌悬浮剂中毒素蛋白质量分数指标(见４􀆰２,HG/T３６１８—１９９９的３􀆰２); ———更改了苏云金杆菌悬浮剂的pH指标(见４􀆰２,HG/T３６１７—１９９９的３􀆰２); ———更改了苏云金杆菌悬浮剂的湿筛试验指标(见４􀆰２,HG/T３６１７—１９９９的３􀆰２); ———增加了苏云金杆菌悬浮剂的倾倒性指标(见４􀆰２); ———增加了苏云金杆菌悬浮剂的持久起泡性指标(见４􀆰２); ———增加了苏云金杆菌悬浮剂低温稳定性控制项目和指标(见４􀆰２); ———增加了苏云金杆菌悬浮剂热储稳定性控制项目和指标(见４􀆰２); ———增加了检验规则(见第六章); ———更改了苏云金杆菌悬浮剂的质量保证期的规定(见７􀆰２,HG/T３６１６—１９９９的６􀆰５); ———更改了苏云金杆菌悬浮剂的毒力效价测定的仲裁法(见附录C,HG/T３６１６—１９９９的附录B). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出. 本文件由全国农药标准化技术委员会(SAC/TC１３３)归口. 本文件起草单位:武汉科诺生物科技股份有限公司、沈阳沈化院测试技术有限公司、沈阳化工研究院 有限公司、福建绿安生物农药有限公司、乳山韩威生物科技有限公司、湖北省生物农药工程研究中心. 本文件主要起草人:于海博、刘荷梅、杨闻翰、王婉秋、徐丽娜、徐晓庆、刘华梅、王月莹、张志刚. 本文件所代替文件的历次版本发布情况为: ———１９９９年首次发布为HG/T３６１８—１９９９; ———本次为首次修订. ⅠNY/T４４０８—２０２３ 苏云金杆菌悬浮剂 １　范围 本文件规定了苏云金杆菌悬浮剂的技术要求、试验方法、检验规则、验收和质量保证期以及标志、标 签、包装、储运. 本文件适用于苏云金杆菌鲇泽亚种(B􀆰t􀆰a)和苏云金杆菌库斯塔克亚种(B􀆰t􀆰k)悬浮剂产品生产的 质量控制. 注:苏云金杆菌的其他名称、分类地位和形态学特征等描述见附录A. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T１６０１　农药pH值的测定方法 GB/T１６０４　商品农药验收规则 GB/T１６０５—２００１　商品农药采样方法 GB３７９６　农药包装通则 GB/T８１７０—２００８　数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T１４８２５—２００６　农药悬浮率测定方法 GB/T１６１５０—１９９５　农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法 GB/T１９１３６—２０２１　农药热储稳定性测定方法 GB/T１９１３７—２００３　农药低温稳定性测定方法 GB/T２８１３７　农药持久起泡性测定方法 GB/T３１７３７　农药倾倒性测定方法 GB/T３２７７６—２０１６　农药密度测定方法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 毒素蛋白　toxinprotein 苏云金杆菌在芽孢形成时期产生的一种伴孢晶体蛋白,是使其产品具有杀虫活性的主要物质. ３􀆰２ 毒力效价　toxicitypotency 根据产品的生物活性和对生物体的作用来设计试验,与具有确定国际单位的标样进行对比性生物反 应,测定样品的毒力效果的生物学活性指标,其结果用单位质量的国际单位表示. ４　技术要求 ４􀆰１　外观 可流动、易测量体积的悬浮液体;存放过程中,可能出现沉淀,但经手摇动,应恢复原状,不应有结块. ４􀆰２　技术指标 苏云金杆菌悬浮剂还应符合表１的要求. １NY/T４４０８—２０２３ 表１　苏云金杆菌悬浮剂技术指标 项目指标 ８０００IU/μL规格 ６０００IU/μL规格 毒素蛋白质量分数,％ ≥０􀆰８ ≥０􀆰６ 毒力效价(H􀆰a􀆰)a,(IU/μL) ≥８０００ ≥６０００ pH ４􀆰０~７􀆰０ 悬浮率,％ ≥８０ 倾倒性倾倒后残余物,％ ≤５􀆰０ 洗涤后残余物,％ ≤０􀆰５ 湿筛试验(通过７５mm试验筛),％ ≥９８ 持久起泡性(１min后泡沫量),mL ≤６０ 低温稳定性　冷储后,毒素蛋白质量分数、毒力效价、湿筛试验仍应符合本文件 的要求 热储稳定性 　热储后,pH、湿筛试验、倾倒性仍应符合本文件的要求 　　a　H􀆰a􀆰代表棉铃虫(Helicoverpaarmigera),也可选择小菜蛾和甜菜夜蛾作为试验虫,试验结果分别表示为毒力效价 (P􀆰x􀆰)和毒力效价(S􀆰e􀆰),但应以毒力效价(H􀆰a􀆰)作为仲裁法.P􀆰x􀆰代表小菜蛾(Plutellaxylostella),S􀆰e􀆰代 表甜菜夜蛾(Spodopteraexigua). ５　试验方法 警示:使用本文件的人员应有实验室工作的实践经验.本文件并未指出所有的安全问题.使用者有责任采取适当的 安全和健康措施. ５􀆰１　一般规定 本文件所用试剂和水在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和蒸馏水. ５􀆰２　取样 按GB/T１６０５—２００１中５􀆰３􀆰２的规定执行.用随机数表法确定取样的包装件;最终取样量应不少于 ８００mL. ５􀆰３　鉴别试验 ５􀆰３􀆰１　十二烷基硫酸钠Ｇ聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDSＧPAGE) 本鉴别试验可与毒素蛋白质量分数的测定同时进行.在相同的操作条件下,试样溶液与标样溶液应 具有相同的蛋白区带,由此证明产品中的有效毒素蛋白的相对分子质量为１３００００. ５􀆰３􀆰２　生物测定法 根据代表菌株的形态学和生理生化特征进行菌种鉴别,并可辅助脂肪酸分析、Biolog、１６SrRNA序列 分析等手段.当对鉴别结果有争议或需要进行法律仲裁检验时,应到具有菌种鉴定资质的单位,将待检菌 株与模式菌种进行比对,出具菌种鉴定报告,作为仲裁依据. 有效成分的特征见附录A. ５􀆰４　外观的测定 采用目测法测定. ５􀆰５　毒素蛋白质量分数的测定 ５􀆰５􀆰１　方法提要 用碱性溶液处理苏云金杆菌悬浮剂伴孢晶体,使其降解为毒素蛋白,然后通过SDSＧPAGE,依蛋白质相 对分子质量的差异,使毒素蛋白与其他杂蛋白分离,之后用电泳凝胶成像系统扫描蛋白区带面积,进行定量. ５􀆰５􀆰２　试剂和溶液 ５􀆰５􀆰２􀆰１　水. ５􀆰５􀆰２􀆰２　十二烷基硫酸钠. ５􀆰５􀆰２􀆰３　三羟基甲基氨基甲烷. ５􀆰５􀆰２􀆰４　浓盐酸. ２NY/T４４０８—２０２３ ５􀆰５􀆰２􀆰５　氢氧化钠. ５􀆰５􀆰２􀆰６　甘氨酸. ５􀆰５􀆰２􀆰７　甘油. ５􀆰５􀆰２􀆰８　巯基乙醇. ５􀆰５􀆰２􀆰９　溴酚蓝. ５􀆰５􀆰２􀆰１０　考马斯亮蓝RＧ２５０. ５􀆰５􀆰２􀆰１１　甲醇. ５􀆰５􀆰２􀆰１２　冰乙酸. ５􀆰５􀆰２􀆰１３　无水乙醇. ５􀆰５􀆰２􀆰１４　０􀆰５５mol/L氢氧化钠溶液:在烧杯中量取１００mL水,缓慢加入２􀆰２g氢氧化钠,边加入边搅 拌溶解,待充分溶解后,放置室温,密闭保存备用. ５􀆰５􀆰２􀆰１５　１mol/L、pH６􀆰８三羟基甲基氨基甲烷Ｇ盐酸缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷１２􀆰１g溶于水 中,用浓盐酸调至pH６􀆰８,用水定容至１００mL. ５􀆰５􀆰２􀆰１６　电泳缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷３􀆰０g、甘氨酸１４􀆰４g、十二烷基硫酸钠１g,用水溶解并 定容至１０００mL. ５􀆰５􀆰２􀆰１７　３×样品稀释液:１mol/L、pH６􀆰８三羟基甲基氨基甲烷Ｇ盐酸缓冲液１８􀆰７５mL,十二烷基硫酸 钠６g,甘油３０mL,巯基乙醇１５mL,少许溴酚蓝０􀆰５g,用水定容至１００mL. ５􀆰５􀆰２􀆰１８　染色液:称取考马斯亮蓝RＧ２５０１􀆰０g,加入甲醇４５０mL、冰乙酸１００mL、水４５０mL,溶解过 滤后使用. ５􀆰５􀆰２􀆰１９　脱色液:量取甲醇１００mL、冰乙酸３５mL,用水定容至１０００mL. ５􀆰５􀆰２􀆰２０　漂洗液:量取无水乙醇３０mL、冰乙酸１０mL、水６０mL,混合均匀后使用. ５􀆰５􀆰２􀆰２１　固定液:量取冰乙酸７５mL,用水定容至１０００mL.混合均匀后使用. ５􀆰５􀆰２􀆰２２　毒素蛋白(相对分子质量为１３００００)标样:已知质量分数,ω≥９􀆰０％. ５􀆰５􀆰３　仪器 ５􀆰５􀆰３􀆰１　电泳仪. ５􀆰５􀆰３􀆰２　夹芯式垂直电泳槽(１􀆰０mm凹形带槽橡胶模框)、凝胶板(１􀆰０mm,１５孔或１０孔样品槽模