2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 － － 2 0 2 4 0 5 0 1 － － 实 施 牛 蜘 蛛 腿 综 合 征 检 测 P C R 法 4 3 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 3 0 C C S B 4 4 2 2 — 2 0 2 3 D e t e c t i o n o f a r a c h n o m e l i a s y n d r o m e i n c a t t l e — P C R m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４４２２—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC２７４)归口. 本文件起草单位:中国农业大学、新疆农业大学. 本文件主要起草人:王雅春、初芹、焦士会、黄锡霞、谢振全、田月珍、马毅、俞英、张毅、王丹、胡丽蓉. ⅠNY/T４４２２—２０２３ 牛蜘蛛腿综合征检测　PCR法 １　范围 本文件描述了牛蜘蛛腿综合征检测的PCR法. 本文件适用于西门塔尔牛、瑞士褐牛、中国西门塔尔牛、新疆褐牛、三河牛、蜀宣花牛及其他含有西门 塔尔牛和/或褐牛血缘个体的蜘蛛腿综合征的遗传检测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T１９４９５􀆰２　转基因产品检测　实验室技术要求 GB/T２７６４２　牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法 农业部２０３１号公告—１４—２０１３　转基因动物及其产品成分检测　普通牛(Bostaurus)内标准基因 定性PCR方法 NY/T２６９５　牛遗传缺陷基因检测技术规程 NY/T３４４６　奶牛短脊椎畸形综合征检测PCR法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 牛蜘蛛腿综合征　arachnomeliasyndrome,AS 一种牛的先天性、致死性骨骼系统畸形、临床表现四肢外观像“蜘蛛腿”的常染色体遗传病. 注:患病犊牛头部畸形,包括下颌骨短,上颌骨向下凹陷,上颌前端呈圆锥形,并向上微微翘起;脊柱向背侧弯曲,明显 “蜷缩驼背”状态,但肋骨和肩胛骨正常;四肢僵直,骨骼畸形,后肢畸形尤为严重,掌骨和跖骨向内侧弯曲与身体平 行或呈一定角度,长骨骨端正常,长骨骨干比正常犊牛细而脆弱,外径和内径偏小但骨密质部分的宽度未发生改 变,四肢外观像“蜘蛛腿”. [来源:NY/T２６９５—２０１５,３􀆰９,有修改] ４　原理 根据褐牛AS致因突变位点和西门塔尔牛AS致因突变位点的侧翼序列设计特异性引物,并在上游 引物５′端分别加上HEX和FAM荧光标记,随后对DNA样品进行PCR扩增,获得与预期片段大小一致 的PCR产物.PCR产物变性解链后,经毛细管电泳技术进行片段分离,依据荧光吸收峰图鉴定片段长 度,判定基因型,确定被检个体为携带者还是正常个体. 注１:褐牛AS致因突变位点为牛５号染色体上亚硫酸盐氧化酶(sulfiteoxidase,SUOX)基因外显子４上１３６bp~１３７ bp之间的１个G碱基插入,cDNA上的位置为３６３bp~３６４bp,即表示为c􀆰３６３—３６４insG位点. 注２:西门塔尔牛AS致因突变位点为牛２３号染色体上钼辅因子合成蛋白１(molybdenumcofactorsynthesis１, MOCS１)基因外显子１１上１１０bp~１１１bp处的CA碱基缺失,cDNA上的位置为１２２４bp~１２２５bp,即表示为 c􀆰１２２４—１２２５delCA位点. ５　试剂和材料 ５􀆰１　主要试剂和配制 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水. １NY/T４４２２—２０２３ ５􀆰１􀆰１　去离子甲酰胺(纯度为１００％). ５􀆰１􀆰２　DNA分子量标记:可以清楚区分１００bp~１０００bp的DNA片段. ５􀆰１􀆰３　TaqDNA聚合酶. ５􀆰１􀆰４　PCR缓冲液. ５􀆰１􀆰５　氯化镁溶液(２５mmol/L). ５􀆰１􀆰６　乙二胺四乙酸溶液[５００mmol/LEDTA(pH８􀆰０)]:称取二水乙二胺四乙酸二钠１８６􀆰１g,溶于 ８００mL水中,加氢氧化钠约２０g,调pH至８􀆰０,加水定容至１０００mL.高压灭菌条件为１２１℃,１􀆰０３４× １０５Pa,蒸汽灭菌３０min. ５􀆰１􀆰７　５０×TAE储存液:称取２４２􀆰２g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用５００mL水加热搅拌溶解后,加入 １００mL乙二胺四乙酸溶液(５􀆰１􀆰６),用冰乙酸调pH至８􀆰０,然后加水定容至１０００mL. ５􀆰１􀆰８　１×TAE缓冲液:５０×TAE储存液８０mL(５􀆰１􀆰７),加水定容至４０００mL. ５􀆰１􀆰９　６×凝胶载样缓冲液:称取０􀆰２５g溴酚蓝、０􀆰２５g二甲苯氰、４０g蔗糖,加水溶解后,定容至１００ mL,４℃保存. ５􀆰１􀆰１０　dNTPs混合溶液(各２􀆰５mmol/L):将浓度为１０mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP４种脱 氧核糖核苷酸溶液等体积混合. ５􀆰２　荧光标记引物 ５􀆰２􀆰１　SUOX基因荧光标记引物 SUOXＧF:５′ＧCTCAAGAGTCACCACGCAGATＧ３′; SUOXＧR:５′ＧATGGAGGGTGCCTTGTCGTCＧ３′. 预期扩增片段大小为２７４bp或２７５bp(见附录A). 注:SUOXＧF引物５′端标记荧光报告基团(HEX). ５􀆰２􀆰２　MOCS１基因荧光标记引物 MOCS１ＧF:５′ＧCTGAGTCTCCTCTTCTGTTTTCAＧ３′; MOCS１ＧR:５′ＧGTTGGCATCTGAGTCCAGGTＧ３′. 预期扩增片段大小为２５０bp或２４８bp(见附录A). 注:MOCS１ＧF引物５′端标记荧光报告基团(FAM). ６　仪器设备 ６􀆰１　全自动毛细管电泳分析系统:分辨率为１bp,检测最低浓度可达５pg/μL. ６􀆰２　分析天平:感量０􀆰１g和０􀆰１mg. ６􀆰３　PCR扩增仪:升降温速度＞１􀆰５℃/s,孔间温度差异＜１􀆰０℃. ６􀆰４　电泳槽、电泳仪等电泳装置. ６􀆰５　凝胶成像系统或照相系统. ７　检测方法 ７􀆰１　试样制备 按照NY/T３４４６的规定执行. ７􀆰２　DNA提取 按照GB/T２７６４２的规定执行. ７􀆰３　DNA浓度和纯度检测 按照农业部２０３１号公告—１４—２０１３的规定执行. ７􀆰４　PCR扩增 ７􀆰４􀆰１　试样PCR扩增 ２NY/T４４２２—２０２３ 使用５􀆰２􀆰１和５􀆰２􀆰２中列出的荧光标记引物分别对试样DNA进行PCR扩增,每个试样每个反应设 置２个平行.PCR扩增体系如表１所示. 表１　PCR扩增反应体系 项目 体积 水 — ２５mmol/L氯化镁溶液 １􀆰２５μL １０×PCR缓冲液 ２􀆰０μL １０mmol/LdNTPs混合溶液(各２􀆰５mmol/L) ２􀆰０μL １０μmol/L上游引物F １􀆰５μL １０μmol/L下游引物R １􀆰５μL ５０ng/μL~１００ng/μLDNA模板 １􀆰０μL ５U/μLTaqDNA聚合酶 ０􀆰２５μL 总体积 ２０μL 　　注１:“—”表示水体积.如果PCR缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,并相应调整水的体积,使反应总体积达到 ２０μL. 注２:SUOX基因PCR反应,上游引物F指SUOXＧF,下游引物指SUOXＧR;MOCS１基因PCR反应,上游引物F指 MOCS１ＧF,下游引物R指MOCS１ＧR. ７􀆰４􀆰２　对照样PCR扩增 在试样PCR扩增的同时,应设置阳性对照、阴性对照和空白对照. 以同时携带褐牛AS致因突变位点和西门塔尔牛AS致因突变位点的基因组DNA作为阳性对照;以 正常个体DNA作为阴性对照;以水作为空白对照.对照样PCR扩增反应体系如表１所示. 注:阳性对照优先选择有证的标准物质或标准样;如果没有,可以根据附录A中序列人工合成. ７􀆰４􀆰３　扩增条件 ９５℃预变性５min;９５℃变性３０s、６３℃退火３０s、７２℃延伸３０s,３５个循环;７２℃延伸１０min. ７􀆰５　PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 按照NY/T２６９５的规定执行.扩增片段大小与预期片段大小一致时,进行全自动毛细管电泳检测. ７􀆰６　全自动毛细管电泳检测 ７􀆰６􀆰１　PCR产物混合与稀释 将同一样品的SUOX和MOCS１基因的PCR产物各取５μL等体积混合,加入５００μL的水稀释. ７􀆰６􀆰２　毛细管电泳检测 取稀释后PCR产物１μL,加入去离子甲酰胺９μL、DNA分子量标记０􀆰６μL,混匀.９５℃变性５min 后,立即转移至冰浴５min,全自动毛细管电泳检测系统上样检测. ８　结果分析与表述 ８􀆰１　对照检测结果分析 阳性对照和阴性对照的PCR反应中,SUOX和MOCS１基因序列得到特异性扩增,且扩增片段 大小与预期片段大小一致,而空白对照中没有预期扩增片段,表明PCR反应体系正常工作;否则,重 新扩增. ８􀆰２　试样检测结果分析与表述 ８􀆰２􀆰１　正常个体 SUOX基因PCR产物有１个信号峰(位于２７４bp处),MO