2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 － － 2 0 2 4 0 5 0 1 － － 实 施 饲 料 中 米 诺 地 尔 的 测 定 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 4 2 5 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f m i n o d i x i l i n f e e d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４４２５—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:上海市兽药饲料检测所、上海市农业科学院. 本文件主要起草人:黄士新、张婧、王博、严凤、吴剑平、曹莹、白冰、商军、杨海锋、黄家莺、华贤辉、徐 汀、潘娟、司文帅、陶玉洁、贡松松. ⅠNY/T４４２５—２０２３ 饲料中米诺地尔的测定 １　范围 本文件描述了饲料中米诺地尔的液相色谱Ｇ串联质谱和高效液相色谱测定方法. 本文件液相色谱Ｇ串联质谱法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合型饲 料添加剂中米诺地尔的测定;高效液相色谱法适用于浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合型 饲料添加剂中米诺地尔的测定. 本文件液相色谱Ｇ串联质谱法检出限为５􀆰０μg/kg、定量限为１０􀆰０μg/kg,高效液相色谱法的检出限为 １􀆰０mg/kg、定量限为２􀆰０mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　液相色谱Ｇ串联质谱法(仲裁法) ４􀆰１　原理 试样中的米诺地尔用甲醇振荡提取,经混合型强阳离子固相萃取小柱净化,液相色谱Ｇ串联质谱仪测 定,外标法定量. ４􀆰２　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ４􀆰２􀆰１　水:GB/T６６８２,一级. ４􀆰２􀆰２　甲醇. ４􀆰２􀆰３　甲醇:色谱纯. ４􀆰２􀆰４　乙腈:色谱纯. ４􀆰２􀆰５　甲酸:色谱纯. ４􀆰２􀆰６　５％氨水甲醇溶液:取５mL氨水,加甲醇(４􀆰２􀆰２)稀释至１００mL,混匀. ４􀆰２􀆰７　０􀆰１％甲酸溶液:取１mL甲酸(４􀆰２􀆰５),加水稀释至１０００mL,混匀. ４􀆰２􀆰８　０􀆰１％甲酸乙腈溶液:取１mL甲酸(４􀆰２􀆰５),加乙腈(４􀆰２􀆰４)稀释至１０００mL,混匀. ４􀆰２􀆰９　标准储备溶液(１mg/mL):称取米诺地尔标准品(CAS号:３８３０４Ｇ９１Ｇ５,纯度不低于９８％)１０mg (精确至０􀆰００００１g)于１０mL棕色容量瓶中,用甲醇(４􀆰２􀆰３)溶解定容.－１８℃以下避光保存,有效期为 ６个月. ４􀆰２􀆰１０　标准中间溶液Ⅰ(１００μg/mL):准确移取标准储备溶液(４􀆰２􀆰９)２mL于２０mL棕色容量瓶中, 用０􀆰１％甲酸溶液(４􀆰２􀆰７)定容.２℃~８℃避光保存,有效期为３个月. ４􀆰２􀆰１１　标准中间溶液Ⅱ(１μg/mL):准确移取标准中间溶液Ⅰ(４􀆰２􀆰１０)１mL于１００mL棕色容量瓶 中,用０􀆰１％甲酸溶液(４􀆰２􀆰７)定容.２℃~８℃避光保存,有效期为３个月. １NY/T４４２５—２０２３ ４􀆰２􀆰１２　标准系列溶液:分别准确移取适量标准中间溶液Ⅱ(４􀆰２􀆰１１)于棕色容量瓶中,用０􀆰１％甲酸溶液 (４􀆰２􀆰７)稀释、定容,配制成浓度为０􀆰１ng/mL、１ng/mL、１０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、２００ng/mL 标准系列溶液.临用现配. ４􀆰２􀆰１３　混合型强阳离子固相萃取小柱:６０mg/３mL. ４􀆰２􀆰１４　微孔滤膜:０􀆰２２μm,水系. ４􀆰３　仪器设备 ４􀆰３􀆰１　液相色谱Ｇ串联质谱仪:配电喷雾离子源. ４􀆰３􀆰２　天平:精度为０􀆰０１g和０􀆰００００１g. ４􀆰３􀆰３　振荡器:转速５００r/min~３０００r/min. ４􀆰３􀆰４　离心机:转速不低于９０００r/min. ４􀆰３􀆰５　涡旋混合器. ４􀆰３􀆰６　固相萃取装置. ４􀆰３􀆰７　氮吹仪. ４􀆰４　样品 按GB/T２０１９５的规定制备试样,不少于２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的分析筛,充分混 匀,装入磨口瓶,备用. ４􀆰５　试验步骤 ４􀆰５􀆰１　提取 平行做２份试验.称取试样２g(精确至０􀆰０１g),于５０mL离心管中,准确加入２０mL甲醇(４􀆰２􀆰２), １５００r/min振荡提取２０min,９０００r/min离心５min,准确移取上清液０􀆰５mL于１０mL离心管中,加入 ２mL０􀆰１％甲酸溶液(４􀆰２􀆰７),涡旋混匀,备用. ４􀆰５􀆰２　净化 固相萃取小柱(４􀆰２􀆰１３)依次用３mL甲醇(４􀆰２􀆰２)和３mL水预淋洗,取备用液(４􀆰５􀆰１)全部过柱,依 次用３mL水和３mL甲醇(４􀆰２􀆰２)淋洗,用３mL５％氨水甲醇溶液(４􀆰２􀆰６)洗脱,收集洗脱液,于５０℃下 用氮气吹干,准确加入１mL０􀆰１％甲酸溶液(４􀆰２􀆰７),溶解,涡旋混匀,用微孔滤膜(４􀆰２􀆰１４)过滤,待测. ４􀆰５􀆰３　测定 ４􀆰５􀆰３􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长１００mm,内径２􀆰１mm,粒径１􀆰７μm,或性能相当者; b)　流动相:A相为０􀆰１％甲酸溶液(４􀆰２􀆰７),B相为０􀆰１％甲酸乙腈溶液(４􀆰２􀆰８),梯度洗脱程序见 表１; c)　柱温:３５℃; d)　流速:０􀆰３mL/min; e)　进样量:１０μL. 表１　梯度洗脱程序 时间,min A相,％ B相,％ ０􀆰００ ８０ ２０ ２􀆰００ ８０ ２０ ２􀆰１０ ５ ９５ ３􀆰００ ５ ９５ ３􀆰１０ ８０ ２０ ６􀆰００ ８０ ２０ ２NY/T４４２５—２０２３ ４􀆰５􀆰３􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI＋); b)　检测方式:多反应监测(MRM); c)　脱溶剂气:８００L/h; d)　反吹气:５０L/h; e)　雾化器温度:５００℃; f)　电离电压:３􀆰５kV; g)　离子源温度:１５０℃. h)　多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量见表２. 表２　米诺地尔多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量参考值 被测物名称监测离子对 m/z锥孔电压 V碰撞能量 eV 米诺地尔２１０􀆰０＞１６３􀆰９ ３０ ２５ ２１０􀆰０＞１９２􀆰９a３０ １５ 　　a　为定量离子. ４􀆰５􀆰３􀆰３　标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取标准系列溶液(４􀆰２􀆰１２)和试样溶液(４􀆰５􀆰２)上机测定.米诺地尔特征离 子质量色谱图见附录A. ４􀆰５􀆰３􀆰４　定性测定 在相同试验条件下,试样溶液中米诺地尔的保留时间应与标准系列溶液(浓度相当)中米诺地尔的保 留时间一致,其相对偏差在±２􀆰５％之内.根据表２选择的监测离子对,比较试样谱图中米诺地尔监测离 子对的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中监测离子对的相对离子丰度,若偏差不超过表３规定 的范围,则可判定为样品中存在米诺地尔. 表３　定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 最大允许偏差 ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ４􀆰５􀆰３􀆰５　定量测定 以米诺地尔的浓度为横坐标、定量离子对峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,其相关系数应不低于 ０􀆰９９.用单点或多点进行定量,试样溶液中待测物的浓度应在标准曲线的线性范围内.如超出范围,应将 试样溶液用０􀆰１％甲酸溶液(４􀆰２􀆰７)稀释后,重新测定.单点校准定量时,试样溶液中待测物的浓度与标 准溶液浓度相差不超过３０％. ４􀆰６　试验数据处理 试样中米诺地尔含量以质量分数计.多点校准按公式(１)计算,单点校准按公式(２)计算. w１＝ρ１×V１×V３×１０００ V２×m×１０００×n (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: w１———试样中米诺地尔含量的数值,单位为微克每千克(μg/kg); ρ１———由标准曲线得到的试样溶液中米诺地尔的浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL); V１———试样提取液体积的数值,单位为毫升(mL); V３———净化后最终定容体积的数值,单位为毫升(mL); １０００———换算系数; ３NY/T４４２５—２０２３ V２———用于净化的上清液体积的数值,单位为毫升(mL); m———试样质量的数值,单位为克(g); n———稀释倍数. w１＝A×V１×V３×ρ′s×１０００ As×V２×m×１０００×n (２) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: A　———试样溶液的色谱峰面积; ρ′s———标准溶液中米诺地尔浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL); As———标准溶液色谱峰面积. 测定结果以平行测定的算术平均值表示,保留３位有效数字. ４􀆰７　精密度 在重复性条件下,２次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于其算