2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 － － 2 0 2 4 0 5 0 1 － － 实 施 饲 料 中 二 硝 托 胺 的 测 定 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 4 2 6 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f d i n i t o l m i d e i n f e e d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 农 业 部 7 8 3 号 公 告 — 5 — 2 0 0 6NY/T４４２６—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替农业部７８３号公告—５—２００６«饲料中二硝托胺的测定　高效液相色谱法»,与农业部７８３ 号公告—５—２００６相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　更改了适用范围(见第１章,２００６年版的第１章); b)　增加了高效液相色谱法检出限(见第１章); c)　增加了液相色谱Ｇ串联质谱法(见第４章); d)　更改了称样量和提取方法(见４􀆰５􀆰１和５􀆰５􀆰１,２００６年版的７􀆰１); e)　更改了净化方法(见４􀆰５􀆰２和５􀆰５􀆰２,２００６年版的７􀆰２); f)　更改了色谱参考条件(见４􀆰５􀆰３􀆰１、５􀆰５􀆰３􀆰１和５􀆰５􀆰３􀆰２,２００６年版的７􀆰３􀆰１). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:宁波市农产品质量检测中心. 本文件主要起草人:王全胜、张亮、吴银良、凌淑萍、付岩、朱勇、应永飞、徐峰. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２００６年首次发布为农业部７８３号公告—５—２００６; ———本次为第一次修订. ⅠNY/T４４２６—２０２３ 饲料中二硝托胺的测定 １　范围 本文件描述了饲料中二硝托胺的液相色谱Ｇ串联质谱和高效液相色谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中二硝托胺的测定. 本文件中液相色谱Ｇ串联质谱法的检出限为０􀆰０１mg/kg、定量限为０􀆰０５mg/kg,高效液相色谱法的 检出限为０􀆰３mg/kg、定量限为１􀆰０mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　液相色谱Ｇ串联质谱法 ４􀆰１　原理 试样经氨化甲醇提取,中性氧化铝固相萃取净化,液相色谱Ｇ串联质谱仪检测,外标法定量. ４􀆰２　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ４􀆰２􀆰１　水:GB/T６６８２,一级. ４􀆰２􀆰２　乙腈:色谱纯. ４􀆰２􀆰３　甲醇:色谱纯. ４􀆰２􀆰４　甲酸:色谱纯. ４􀆰２􀆰５　０􀆰５％氨水甲醇溶液:取氨水５mL,用甲醇定容至１０００mL,混匀. ４􀆰２􀆰６　０􀆰１％甲酸溶液:取甲酸(４􀆰２􀆰４)１mL,用水稀释至１０００mL,混匀. ４􀆰２􀆰７　甲酸Ｇ乙腈溶液:取０􀆰１％甲酸溶液(４􀆰２􀆰６)８００mL,用乙腈(４􀆰２􀆰２)稀释至１０００mL,混匀. ４􀆰２􀆰８　标准储备溶液(１mg/mL):称取二硝托胺标准品(CAS号:１４８Ｇ０１Ｇ６,纯度不低于９８％)１０mg(精 确至０􀆰０１mg),置于１０mL容量瓶中,用乙腈(４􀆰２􀆰２)溶解并定容,混匀.于－１８℃以下保存,有效期３ 个月. ４􀆰２􀆰９　标准中间溶液(２５μg/mL):准确移取标准储备溶液(４􀆰２􀆰８)０􀆰２５mL,置于１０mL容量瓶中,用乙 腈(４􀆰２􀆰２)稀释、定容、混匀.于－１８℃以下保存,有效期１个月. ４􀆰２􀆰１０　标准系列溶液:准确移取标准中间溶液(４􀆰２􀆰９),分别用０􀆰１％甲酸溶液(４􀆰２􀆰６)和乙腈(４􀆰２􀆰２) 稀释、定容至１mL,混匀,配制成浓度分别为２ng/mL、５ng/mL、２０ng/mL、５０ng/mL、２００ng/mL和 ５００ng/mL的标准系列溶液.临用现配. ４􀆰２􀆰１１　固相萃取柱:中性氧化铝柱,１g/６mL,或性能相当者. ４􀆰２􀆰１２　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. １NY/T４４２６—２０２３ ４􀆰３　仪器设备 ４􀆰３􀆰１　液相色谱Ｇ串联质谱仪:配电喷雾离子源. ４􀆰３􀆰２　离心机:转速不低于１００００r/min. ４􀆰３􀆰３　分析天平:感量０􀆰０１mg和０􀆰０１g. ４􀆰３􀆰４　振荡器. ４􀆰３􀆰５　涡旋混合器. ４􀆰３􀆰６　固相萃取装置. ４􀆰３􀆰７　可控温氮吹仪. ４􀆰４　样品 按GB/T２０１９５的规定制备样品,至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的分析筛,充分混 匀,装入磨口瓶中,保存,备用. ４􀆰５　试验步骤 ４􀆰５􀆰１　提取 平行做２份试验.称取试样５g(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为２g),精确至０􀆰０１g,置于５０mL 塑料离心管中,准确加入２０mL(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为１０mL)氨水甲醇溶液(４􀆰２􀆰５),涡旋 ３０s,振荡提取４０min,于９５００r/min离心３min,移取上清液.残渣重复提取１次,振荡２０min,离心后 合并上清液.待净化. ４􀆰５􀆰２　净化 用５mL甲醇(４􀆰２􀆰３)活化固相萃取小柱(４􀆰２􀆰１１).准确移取５mL(浓缩饲料和添加剂预混合饲料 为２􀆰５mL)待净化溶液(４􀆰５􀆰１)过柱,用４mL(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为２mL)甲醇(４􀆰２􀆰３)洗脱, 收集洗脱液,用甲醇(４􀆰２􀆰３)定容至１０mL(浓缩饲料和添加剂预混合饲料为５mL),混匀.准确移取 １mL于４５℃下用氮气吹干,准确加入１mL甲酸Ｇ乙腈溶液(４􀆰２􀆰７)溶解残渣,涡旋混匀,微孔滤膜 (４􀆰２􀆰１２)过滤,备用. ４􀆰５􀆰３　测定 ４􀆰５􀆰３􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长１００mm,内径２􀆰１mm,粒度１􀆰７μm,或性能相当者; b)　柱温:３５℃; c)　进样量:１０μL; d)　流动相:A相为０􀆰１％甲酸溶液(４􀆰２􀆰６);B相为乙腈(４􀆰２􀆰２),梯度洗脱程序见表１; e)　流速:０􀆰２mL/min. 表１　梯度洗脱程序 时间,min A相,％ B相,％ ０ ８０ ２０ ０􀆰５ ８０ ２０ ３􀆰０ ２０ ８０ ３􀆰５ ２０ ８０ ３􀆰６ ８０ ２０ ５􀆰０ ８０ ２０ ４􀆰５􀆰３􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾电离,负离子模式(ESI－); b)　检测方式:多反应监测(MRM); ２NY/T４４２６—２０２３ c)　毛细管电压:２􀆰５kV; d)　离子源温度:１５０℃; e)　脱溶剂温度:５００℃; f)　脱溶剂气:氮气１０００L/h; g)　多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量见表２. 表２　待测物多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值 待测物名称 监测离子对,m/z 锥孔电压,V 碰撞能量,eV 二硝托胺２２４􀆰１＞７６􀆰９ ２２ ２２ ２２４􀆰１＞１８１􀆰１a２２ １０ 　　a　为定量离子对. ４􀆰５􀆰３􀆰３　标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取二硝托胺标准系列溶液(４􀆰２􀆰１０)和试样溶液(４􀆰５􀆰２)上机测定.标准溶 液液相色谱Ｇ串联质谱定量离子对色谱图见附录A中图A􀆰１. ４􀆰５􀆰３􀆰４　定性 在相同试验条件下,试样溶液与标准系列溶液(浓度相当)中二硝托胺的保留时间相对偏差在±２􀆰５％ 之内.根据表２选择的定性离子对,比较试样谱图中二硝托胺定性离子对的相对离子丰度与浓度接近的 标准系列溶液中对应的定性离子对的相对离子丰度,若偏差不超过表３规定的范围,则可判定为样品中存 在二硝托胺. 表３　定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 最大允许偏差 ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ４􀆰５􀆰３􀆰５　定量 以二硝托胺标准溶液的浓度为横坐标、定量离子对的色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,标准曲线 的相关系数应不低于０􀆰９９.试样溶液与标准溶液中二硝托胺的响应值均应在仪器检测的线性范围内,如 超出线性范围,应将试样溶液作相应稀释后重新测定.单点校准定量时,试样溶液中二硝托胺的浓度与标 准溶液浓度相差不超过３０％. ４􀆰６　试验数据处理 试样中二硝托胺的含量以质量分数计.多点校准按公式(１)计算,单点校准按公式(２)计算. w＝ρ１×V×V１×V２×１０００ V３×V４×m(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: w　———试样中二硝托胺含量的数值,单位为毫克每千克(mg/kg); ρ１———由标准曲线得到的试样溶液中二硝托胺质量浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL); V———试样提取溶液体积的数值,单位为毫升(mL); V１———净化后溶液定容体积的数值,单位为毫升(mL); V２———氮吹后最终定容体积的数值,单位为毫升(mL); １０００———换算系数; V３———用于净化的提取溶液体