2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 － － 2 0 2 4 0 5 0 1 － － 实 施 香 石 竹 斑 驳 病 毒 的 检 测 荧 光 定 量 P C R 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 4 3 0 — 2 0 2 3 D e t e c t i o n o f c a r n a t i o n m o t t l e v i r u s — R e a l - t i m e f l u o r e s c e n t P C R m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４４３０—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件主要起草单位:云南省农业科学院花卉研究所、云南农业大学、中国农业大学、云南云科花卉有 限公司、玉溪云星生物科技有限公司、国家观赏园艺工程技术研究中心、农业农村部花卉产品质量监督检 验测试中心(昆明)、云南省花卉育种重点实验室、云南省花卉工程技术研究中心、云南省花卉标准化技术 委员会、昆明市花卉遗传改良重点实验室. 本文件主要起草人:瞿素萍、张艺萍、刘冠泽、王丽花、王继华、杨秀梅、高俊平、杨春梅、许凤、张丽芳、 马男、苏艳、邹凌、蒋亚莲、单芹丽、莫锡君. ⅠNY/T４４３０—２０２３ 香石竹斑驳病毒的检测　荧光定量PCR法 １　范围 本文件规定了香石竹斑驳病毒(carnationmottlevirus,CarMV)的荧光定量PCR检测方法. 本文件适用于香石竹(Dianthuscaryophyllus)栽培品种的种苗、植株及其他组织中香石竹斑驳病毒 的检测和判定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 外壳蛋白基因　coatproteingene 编码病毒外壳蛋白的基因,可作为病毒检测的靶标,简称cp基因. ３􀆰２ TaqMan探针　TaqManprobes 一种检测寡核苷酸的荧光探针,其５′末端携带荧光基团(如FAM、TET、VIC、HEX等),３′端携带淬 灭基团(如TAMRA、BHQ等). ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. CarMV:香石竹斑驳病毒(Carnationmottlevirus) Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cyclethreshold) DEPC:焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate) dNTPs:脱氧核苷三磷酸混合液(deoxynucleosidetriphosphatemixture),由４种脱氧核糖核苷酸 dATP、dGTP、dTTP、dCTP等量混合而成的溶液 PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] ５　香石竹斑驳病毒的基本信息 香石竹斑驳病毒属番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)麝香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)典型成员. 详细信息见附录A. ６　原理 利用香石竹斑驳病毒CP基因的高度保守区域的一段１３０bp序列设计实时荧光引物和探针,根据香 石竹斑驳病毒的实时荧光PCR检测结果对香石竹斑驳病毒进行检测鉴定. ７　仪器和设备 ７􀆰１　实时荧光定量PCR仪. １NY/T４４３０—２０２３ ７􀆰２　电泳仪. ７􀆰３　凝胶成像系统. ７􀆰４　超微量紫外可见光分光光度计. ７􀆰５　高速冷冻离心机:离心力１２０００g以上. ７􀆰６　超低温冰箱:－８０℃. ７􀆰７　冰箱:２℃~４℃,－２０℃. ７􀆰８　微量移液器:量程分别为０􀆰１μL~２􀆰５μL、０􀆰５μL~１０μL、５μL~２０μL、１０μL~１００μL、２０μL~ ２００μL、１００μL~１０００μL. ７􀆰９　电子天平:感量为０􀆰０１g. ７􀆰１０　生物安全柜:洁净度１００级以上. ７􀆰１１　超净工作台:洁净度１００级以上. ８　试剂与耗材 除非另有规定,在检测中仅使用分析纯或生化试剂;所有试剂均用无RNA酶的容器分装;实验用水 符合GB/T６６８２的二级水指标,其中涉及PCR扩增的用水应符合GB/T６６８２一级水指标. ８􀆰１　dNTPs:浓度为２􀆰５mmol/L. ８􀆰２　DEPC处理的灭菌纯水. ８􀆰３　引物: 正向引物:５′ＧCGGATAGTCTTGTCAACATACGGＧ３′; 反向引物:５′ＧCCTTATCGTTGCTTGCCTGTＧ３′; TaqMan探针:５′ＧFAMＧAAGGCTGACACTGTGGTGGGCGAＧBHQ１Ｇ３′. ８􀆰４　裂解液:含４􀆰０mol/L硫氰酸胍、０􀆰２mol/L醋酸钠、２５mmol/L乙二胺四乙酸、１􀆰０mol/L醋酸钾 和２􀆰５％(m/V)PVPＧ４０. ８􀆰５　去蛋白液:含３mol/L硫氰酸胍、０􀆰０２１７mol/LTrisＧHCl和５０％(V/V)无水乙醇. ８􀆰６　漂洗液:含１７mmol/LNaCl,１􀆰６mmol/LTrisＧHCl和８０％(V/V)无水乙醇. ８􀆰７　荧光PCR扩增混合液:含有TaqDNA聚合酶(５U/μL)、５′Ｇ引物和３′Ｇ引物、TaqMan探针等的混 合液. ８􀆰８　RNA提取吸附柱及套管. ８􀆰９　可用于荧光PCR的８联管及盖子. ９　样品制备与存放 ９􀆰１　样品制备 样品制备过程中应戴一次性灭菌手套,所使用的工具也应灭菌处理.取样品的叶片或花瓣剪碎后置 于自封袋中.样品制备时,应同时设立阳性对照、阴性对照及空白对照.其中,阳性对照为已知携带香石 竹斑驳病毒的样品,阴性对照已知无香石竹斑驳病毒的样品,空白对照用无菌一级水代替样品. ９􀆰２　样品存放 制备好的样品保存于２℃~８℃且不宜超过２４h;中长期保存应置于－８０℃的超低温冰箱,避免反 复冻融且保存时间不宜超过１年. １０　检测步骤 １０􀆰１　总RNA提取与质量判定 １０􀆰１􀆰１　总RNA提取 取n＋３个２mL无RNA酶的离心管,其中n为检测样品数、１管阳性对照、１管阴性对照、１管空白 ２NY/T４４３０—２０２３ 对照,对每个管进行编号,并在生物安全柜中操作以下步骤: a)　称取１００mg样品材料并迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵快速研磨组织,其间不断加入 液氮,直至研磨成粉末状; b)将研磨成粉末状的样品(５０mg~１００mg)加入含有４５０μL裂解液的１􀆰５mL灭菌离心管中,用 移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀; c)裂解液在１２０００r/min、４℃条件下离心５min后,将上清液小心吸取到新的１􀆰５mL灭菌离心 管中; d)加入c)步骤所吸取上清液１/２体积的无水乙醇,用移液枪将溶液混合均匀; e)立即将混合液(含沉淀)全部转入RNA提取吸附柱中,吸附柱放入收集管中; f)１２０００r/min,离心１min,弃滤液; g)将５００μL的去蛋白液加入至RNA提取吸附柱中,１２０００r/min离心３０s,弃滤液; h)将６００μL的漂洗液加入至RNA提取吸附柱中,１２０００r/min离心３０s,弃滤液; i)加入５００μL漂洗液,重复１遍; j)将吸附柱放回空收集管中,１２０００r/min离心２min,除去漂洗液; k)取出吸附柱,放入一个无RNase的离心管中,在吸附膜的中间部位加５０μLDEPC处理的灭菌 纯水,室温放置５min,１２０００r/min离心２min; l)离心得到的RNA溶液即为提取到的样品总RNA. １０􀆰１􀆰２　总RNA提取质量的判定 RNA质量可通过以下２种方法选择一种进行判定: a)　在超微量紫外可见光分光光度计上测定样品总RNA的光吸收值,当A２６０/A２８０值在１􀆰８~２􀆰０ 时,判定提取的RNA质量符合PCR的扩增要求; b)通过电泳和凝胶成像系统看条带的方法判定RNA质量及浓度,明显有２８SrRNA和１８SrRNA 两条带且亮度高的,判定提取的RNA质量符合PCR的扩增要求. １０􀆰２　实时荧光PCR扩增 １０􀆰２􀆰１　实时荧光PCR检测体系 所有操作在超净工作台上进行,取出实时荧光PCR反应所需试剂,冰上融化后,根据检测样品的数量 配制实时荧光PCR扩增反应液,每个检测样本反应混合液配制见表１. 表１　单个检测样品实时荧光PCR扩增反应混合液配制的组分及使用量 试剂 使用量,μL ２０μL反应体系终浓度 ２×OneStepRTＧPCRBufferⅢ １０􀆰０ １× ExTaqHS(５U/μL) ０􀆰４ ０􀆰１U/μL PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ ０􀆰４ １０μmol/LcpＧqrtF ０􀆰４ ０􀆰２μmol/L １０μmol/LcpＧqrtR ０􀆰４ ０􀆰２μmol/L １０μmol/LcpＧprobe ０􀆰８ ０􀆰４μmol/L 提取的样品RNA模板或对照(２０ng/μL) ２􀆰０ ２ng/μL 一级水 ５􀆰６