2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 － － 2 0 2 4 0 5 0 1 － － 实 施 动 物 冠 状 病 毒 通 用 R T - P C R 检 测 方 法 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 4 4 3 6 — 2 0 2 3 U n i v e r s a l R T - P C R a s s a y f o r a n i m a l c o r o n a v i r u s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４４３６—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:中国动物卫生与流行病学中心. 本文件主要起草人:王楷宬、庄青叶、王素春、潘俊慧、李阳、张富友、李超、李金平、侯广宇、蒋文明、王 静静、刘朔、于晓慧、袁丽萍、左媛媛、尹馨、刘华雷. ⅠNY/T４４３６—２０２３ 引　　言 冠状病毒在分类地位上属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒亚目(Cornidovirineae)、冠状病毒科 (Coronaviridae).２０１８年,国际病毒学分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses, ICTV)将冠状病毒科分为Letovirinae病毒亚科和正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)２个亚科.其中, Letovirinae病毒亚科仅包括一个属,即Alphaletovirus属;而正冠状病毒亚科则包括α、β、γ和δ４个属. 冠状病毒具有宿主多样性,人和多种动物,如猪、牛、羊、禽、犬、猫、鼠、骆驼、蝙蝠、鲸鱼等均可感染,甚至引 发严重疾病,严重威胁人类健康和畜牧业生产安全.目前发现的人和动物冠状病毒至少包括４６个种,有 的种还包含多个不同的病毒株.我国常见的动物冠状病毒,如猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹 泻病毒(PEDV)、牛冠状病毒(BCoV)、马冠状病毒(ECoV)、猫传染性腹膜炎病毒(FCoV)、犬冠状病毒 (CCoV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等动物冠状病毒可引起动物发病、死亡,给畜牧业造成严重的经 济损失.基于国内外动物冠状病毒的流行形势,亟须建立一种动物冠状病毒通用筛查方法.本文件可用 于检测各类动物冠状病毒,对动物疫病防控和公共卫生安全具有重要意义. ⅡNY/T４４３６—２０２３ 动物冠状病毒通用RTＧPCR检测方法 １　范围 本文件规定了动物冠状病毒通用RTＧPCR检测方法的技术要求. 本文件适用于动物组织、分泌物、排泄物及其培养物等样品中动物冠状病毒核酸的检测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB１９４８９　实验室　生物安全通用要求 NY/T５４１　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(BasePair) PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateＧBufferedSalineBuffer) RdRp:RNA依赖性RNA聚合酶(RNAＧdependentRNAPolymerase) RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid) RTＧPCR:逆转录Ｇ聚合酶链反应(ReverseTranscriptionＧPolymeraseChainReaction) ５　试剂和材料 ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　除另有规定外,所用试剂均为分析纯,所用水符合GB/T６６８２规定的二级水. ５􀆰１􀆰２　PBS(０􀆰０１mol/L,pH７􀆰４),配制方法按照附录A中A􀆰１的规定执行. ５􀆰１􀆰３　RNA提取试剂盒. ５􀆰１􀆰４　RTＧPCR一步法扩增试剂盒或其他等效的RTＧPCR扩增试剂盒. ５􀆰１􀆰５　DNA分子量标准(DL２０００bp或其他等效力分子量标准). ５􀆰１􀆰６　上样缓冲液(参照所选购上样缓冲液的说明使用). ５􀆰１􀆰７　电泳缓冲液,配制方法按照A􀆰２的规定执行. ５􀆰１􀆰８　阳性对照:经过培养的鸡传染性支气管炎或猪流行性腹泻病毒. ５􀆰１􀆰９　阴性对照:SPF鸡胚尿囊液或Vero细胞培养物. ５􀆰２　引物 引物针对冠状病毒的RdRp基因的保守区域设计,上游引物CoVＧF的序列为:５′ＧGGTTGGGATＧ TAYCCWAARTGYGAＧ３′,下游引物CoVＧR的序列为:５′ＧYTGTGAACAAAAYTCRTGWGGACCＧ３′, Y为简并碱基(Y:C/T),R为简并碱基(R:A/G),W为简并碱基(W:A/T).扩增产物大小为６００bp. ５􀆰３　仪器设备 １NY/T４４３６—２０２３ ５􀆰３􀆰１　高速台式冷冻离心机:最高转速为１６０００r/min. ５􀆰３􀆰２　PCR扩增仪. ５􀆰３􀆰３　组织匀浆器. ５􀆰３􀆰４　４℃冰箱、－２０℃冰箱和－７０℃冰箱. ５􀆰３􀆰５　高压灭菌锅. ５􀆰３􀆰６　微量可调移液器(１０μL、１００μL、２００μL、１０００μL等不同规格),以及与其配套的无核酸酶吸头. ５􀆰３􀆰７　核酸电泳系统. ５􀆰３􀆰８　凝胶成像系统. ５􀆰３􀆰９　生物安全柜. ５􀆰４　耗材 ５􀆰４􀆰１　１􀆰５mL和２mL的无菌Eppendorf管. ５􀆰４􀆰２　０􀆰２mLPCR管. ６　样品采集与处理 ６􀆰１　采样方法 ６􀆰１􀆰１　分泌物或排泄物拭子样品 ６􀆰１􀆰１􀆰１　咽喉拭子:采取时,要将拭子深入喉头或上腭裂来回刮擦３次~５次,取咽喉分泌液. ６􀆰１􀆰１􀆰２　泄殖腔/肛拭子:将拭子深入肛门或泄殖腔,转２圈~３圈沾取黏液和粪便. ６􀆰１􀆰１􀆰３　将咽喉拭子、肛/泄殖腔拭子分别或一起放入盛有１􀆰０mLPBS的Eppendorf管中,编号备用. 样品的采集按照NY/T５４１的规定执行. ６􀆰１􀆰２　内脏或组织样品 用镊、剪无菌采集气管、肺、脾等样品,置于自封塑料袋中,编号备用. ６􀆰１􀆰３　环境拭子样品 采集时,将拭子在待检测环境位置来回刮擦３次~５次,并置于盛有１􀆰０mLPBS的Eppendorf管中, 编号备用. ６􀆰２　样品保存与运输 采集的样品密封后,采用保温箱或保温桶加冰密封,尽快运送到实验室.采集的样本立即置于２℃~ ８℃冷藏箱或者保温箱暂存,时间不超过２４h;样品不能被及时送到实验室时,应置于－２０℃冰箱中保 存;若需长期保存,应置于－７０℃冰箱,避免反复冻融(最多冻融３次).样品的保存与运输按照NY/T ５４１的规定执行. ６􀆰３　样品处理 ６􀆰３􀆰１　拭子样品处理 将６􀆰１􀆰１中所采集的分泌物、排泄物或环境拭子样品放至室温,混匀,置于高速台式冷冻离心机中 １２０００r/min离心５min,取上清液备用. ６􀆰３􀆰２　内脏或组织样品处理 将６􀆰１􀆰２中所采集的内脏或组织样品,无菌取待检样品约２􀆰０g,置于研钵中充分研磨,再加１０mL PBS混匀,或置于组织匀浆器中,加入１０mLPBS匀浆,然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中１２０００ r/min离心１０min,取上清液转入Eppendorf管中,备用.样品处理要符合GB１９４８９的要求. ７　RTＧPCR ７􀆰１　核酸提取 选择RNA提取试剂盒提取RNA,或等效的其他RNA提取试剂提取RNA.每次提取RNA,应同时 ２NY/T４４３６—２０２３ 包括阳性对照样品和阴性对照样品. ７􀆰２　扩增试剂准备与配制 在反应混合物配制区进行,按照RTＧPCR一步法扩增试剂盒操作说明配制.RTＧPCR反应体系各组 分的配制按照表１的规定执行. 表１　RTＧPCR反应体系的配制 组分 体积,μL ２×１stepBuffer １２􀆰５ 上游引物CoVＧF(１０μmol/L) １􀆰０ 下游引物CoVＧR(１０μmol/L) １􀆰０ 一步法酶混合物 １􀆰０ ddH２O ６􀆰５ 模板RNA ３􀆰０ 总体积 ２５􀆰０ ７􀆰３　加样 在样本处理区进行.在各设定的PCR管中分别加入７􀆰１中制备的RNA溶液各３μL,盖紧管盖后, ５００r/min离心３０s.每次扩增时,应当设立阳性对照、阴性对照及空白对照.阳性对照应用阳性对照样 品提取核酸作为模板,阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板,空白对照应用ddH２O. ７􀆰４　RTＧPCR反应条件 ５０℃反转录３０min;９４℃预变性５min,９４℃变性３０s,５０℃退火３０s,７２℃延伸３０s,进行３５个循 环;７２℃延伸１０min. ７􀆰５　电泳 ７􀆰５􀆰１　制备１􀆰０％琼脂糖凝胶板,配制方法按照A􀆰３的规定执行. ７􀆰５􀆰２　取５μLPCR产物,与１μL上样缓冲液混合,加入琼脂糖凝胶板的加样孔中. ７􀆰５􀆰３　加入DNA分子量标准,作为对照. ７􀆰５􀆰４　盖好电泳仪,插入电极,５V/cm电压电泳,３０min. ７􀆰５􀆰５　用紫外凝胶成像系统查看并保存结果. ７􀆰５􀆰６　用DNA分子量标准进行比较,判断PCR扩增片段大小