2 0 2 3 1 2 2 2 发 布 － － 2 0 2 4 0 5 0 1 － － 实 施 畜 禽 液 体 粪 污 中 四 环 素 类 、 磺 胺 类 和 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 量 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 4 0 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 3 0 C C S B 4 4 4 0 — 2 0 2 3 D e t e r m i n a t i o n o f t e t r a c y c l i n e s , s u l f o n a m i d e s a n d q u i n o l o n e s r e s i d u e s i n l i q u i d m a n u r e o f l i v e s t o c k a n d p o u l t r y — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４４４０—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC２７４)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院都市农业研 究所. 本文件主要起草人:陈刚、陶秀萍、王安如、贾曼、薛毅、胡剑. ⅠNY/T４４４０—２０２３ 畜禽液体粪污中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的 测定　液相色谱Ｇ串联质谱法 １　范围 本文件描述了畜禽液体粪污中４种四环素类(四环素、土霉素、金霉素和多西环素)、１５种磺胺类 (磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲 唑、磺胺甲氧嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧 啶、磺胺噻唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺苯吡唑、磺胺脒、磺胺醋酰钠、磺胺邻二甲氧嘧 啶、磺胺喹 啉)和１４种喹诺酮类(诺氟沙星、氟罗沙星、司帕沙星、奥比沙星、恩诺沙星、达氟沙星、培 氟沙星、二氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、洛美沙星、氧氟沙星、氟甲喹、 喹酸)药物残留量的液相色谱Ｇ 串联质谱测定方法. 本文件适用于猪、牛、鸡等畜禽液体粪污中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定. 本文件畜禽液体粪污中四环素类、磺胺类和喹诺酮类３３种药物残留量的测定方法检出限为２μg/L, 定量限为５μg/L. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２７５２２　畜禽养殖污水采样技术规范 ３　术语和定义 下列术语与定义适用于本文件. ３􀆰１　 畜禽液体粪污　liquidmanureoflivestockandpoultry 畜禽养殖过程中产生的粪便、尿液、污水、养殖垫料和少量散落饲料等组成的液体混合物. 注:一般指干物质(DM)含量＜１５％的畜禽粪污. ４　原理 试样中待测物经Na２EDTAＧMcIIvaine缓冲液和乙腈Ｇ甲醇溶液提取,QuEChERS方法净化,用液相 色谱Ｇ串联质谱仪测定,基质匹配标准溶液校准,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有说明,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２,一级. ５􀆰２　甲醇:色谱纯. ５􀆰３　乙腈:色谱纯. ５􀆰４　萃取盐包:每份含４g无水硫酸钠及１g氯化钠. ５􀆰５　分散净化剂:每份含９００mg无水硫酸钠、１５０mgC１８及５０mgNＧ丙基乙二胺(PSA). ５􀆰６　Na２EDTAＧMcIIvaine缓冲液:准确称取无水磷酸氢二钠１０􀆰９g、乙二胺四乙酸二钠３g、柠檬酸 １２􀆰９g,加水溶解并定容至１０００mL. １NY/T４４４０—２０２３ ５􀆰７　乙腈Ｇ甲醇溶液:量取７５０mL乙腈(５􀆰３)与２５０mL甲醇(５􀆰２),混匀. ５􀆰８　８０％甲醇溶液:量取８００mL甲醇(５􀆰２),加水定容至１０００mL,混匀. ５􀆰９　０􀆰２％甲酸溶液:量取２mL甲酸,加水定容至１０００mL,混匀. ５􀆰１０　０􀆰２％甲酸甲醇溶液:量取２mL甲酸,用甲醇(５􀆰２)定容至１０００mL,混匀. ５􀆰１１　标准储备溶液(１mg/mL):准确称取标准品(见附录A中表A􀆰１)各１０mg(精确至０􀆰０１mg),分别 用表中标明的溶剂溶解,并用甲醇(５􀆰２)定容至１０mL,混匀.置于－１８℃以下避光保存.磺胺类和喹诺 酮类标准储备溶液有效期为６个月,四环素类标准储备溶液有效期为１个月. ５􀆰１２　混合标准中间溶液(５μg/mL):准确吸取标准储备溶液(５􀆰１１)各５０μL于１０mL容量瓶中,用甲醇 (５􀆰２)稀释至刻度,现用现配. ５􀆰１３　混合标准系列工作溶液:准确移取混合标准中间溶液(５􀆰１２)适量,用８０％甲醇溶液(５􀆰８)稀释成２ ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL和２００ng/mL混合标准系列工作溶液,现用现配. ５􀆰１４　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱Ｇ串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI). ６􀆰２　分析天平:感量０􀆰０１mg和０􀆰０１g. ６􀆰３　涡旋混合仪. ６􀆰４　冷冻离心机:转速不低于１００００r/min. ６􀆰５　氮吹仪. ６􀆰６　超声波清洗器. ７　样品 ７􀆰１　按照GB/T２７５２２的规定取样.取样后,样品应在－１８℃以下保存.试验前,取适量恢复至室温的 样品,混匀备用. ７􀆰２　空白样品:选取类型相同、均匀一致且在待测物保留时间处、仪器响应值小于方法定量限３０％的畜 禽液体粪污样品,作为空白试样. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做２份试验.准确移取样品２mL于５０mL离心管中,加入２mLNa２EDTAＧMcIIvaine缓冲液 (５􀆰６),涡旋混匀１min,加入８mL乙腈Ｇ甲醇溶液(５􀆰７)提取,涡旋混匀后超声提取１５min,于４℃条件下 １００００r/min离心１０min.取全部上层清液于５０mL离心管中,加入萃取盐包(５􀆰４),涡旋混匀１min,静 置１０min盐析分层,于４℃条件下１００００r/min离心１０min,取上层有机相,备用. ８􀆰２　净化 取５mL有机相(８􀆰１)于１５mL离心管中,加入一份分散净化剂(５􀆰５),涡旋混匀１min,于４℃条件下 １００００r/min离心５min.取４mL上层清液于４０℃水浴条件下氮气吹干,用８０％甲醇溶液(５􀆰８)定容至 １mL,过０􀆰２２μm微孔滤膜(５􀆰１４),供液相色谱Ｇ串联质谱仪分析测定. ８􀆰３　基质匹配标准系列溶液的制备 取空白样品若干份,按８􀆰１和８􀆰２处理,氮气吹干,得到空白基质.分别准确加入混合标准系列工作 溶液各１mL(５􀆰１３)复溶,配制成２ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、２００ng/mL基质 匹配标准系列溶液. ８􀆰４　测定 ８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 ２NY/T４４４０—２０２３ 色谱柱:C１８柱,柱长１５０mm,内径３􀆰０mm,粒径１􀆰８μm,或性能相当者; 柱温:３０℃; 流速:０􀆰３mL/min; 进样量:５μL; 流动相A:０􀆰２％甲酸溶液(５􀆰９); 流动相B:０􀆰２％甲酸甲醇溶液(５􀆰１０); 梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间,min 流动相A,％ 流动相B,％ ０ ９０ １０ ０􀆰５０ ９０ １０ ０􀆰６０ ６５ ３５ １􀆰００ ６５ ３５ ６􀆰００ １０ ９０ １０􀆰００ １０ ９０ １０􀆰１０ ９０ １０ １５􀆰００ ９０ １０ ８􀆰４􀆰２　串联质谱参考条件 电离方式:电喷雾离子源,正离子模式(ESI＋); 监测方式:多反应监测(MRM); 碰撞气(CAD):３４􀆰４７５kPa(５psi); 雾化气(GS１):４１３􀆰７kPa(６０psi); 辅助气(GS２):４１３􀆰７kPa(６０psi); 喷雾电压(IS):５０００V; 离子源温度(TEM):５００℃; 多反应监测(MRM)离子对、去簇电压及碰撞能量见表２. 表２　３３种药物的多反应监测(MRM)离子对、去簇电压及碰撞能量的参考值 类别 被测物名称 监测离子对,m/z 去簇电压,V 碰撞能量,eV 四环素类四环素 土霉素 金霉素 多西环素４４５􀆰１＞４１０􀆰１a ４４５􀆰１＞４２７􀆰７ ４６１􀆰０＞４２６􀆰３a ４６１􀆰０＞４４３􀆰０ ４７９􀆰１＞４４３􀆰９a ４７９􀆰１＞４６２􀆰０ ４４５􀆰４＞４２７􀆰６a ４４５􀆰４＞４１０􀆰３９０ １１０ １２０ ９０３０ ３０ ２８ １９ ３０ ２５ ２７ ２９ 磺胺类磺胺嘧啶 磺胺二甲基嘧啶 磺胺氯哒嗪 磺胺甲 唑 磺胺甲氧嗪 磺胺对甲氧嘧啶２５１􀆰５＞１５５􀆰９a ２５１􀆰５＞１０８􀆰１ ２７８􀆰９＞１０８􀆰２a ２７８􀆰９＞１５６􀆰２ ２８５􀆰０＞１５６􀆰１a ２８５􀆰０＞１０８􀆰０ ２５４􀆰２＞１５６􀆰１a ２５４􀆰２＞１０８􀆰１ ２８１􀆰０＞１５６􀆰０a ２８１