2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 胡 麻 （ 油 用 亚 麻 ） 品 种 真 实 性 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 4 8 5 — 2 0 2 5 O i l f l a x ( L i n u m u s i t a t i s s i m u m L . ) v a r i e t y g e n u i n e n e s s i d e n t i f i c a t i o n — S S R m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４４８５—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　总则 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　检测方案 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　仪器设备、试剂和溶液配制 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　检测程序 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　鉴定意见 ８ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　结果报告 ８ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　溶液配制 １０ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(资料性)　等位基因扩增片段信息 １２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(资料性)　引物分组信息 １３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录D(资料性)　参照样品及其等位变异信息 １６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４４８５—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１－２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC３７)归口. 本文件起草单位:甘肃省农业科学院作物研究所、北京市农林科学院杂交小麦研究所、全国农业技术 推广服务中心、甘肃农业大学. 本文件主要起草人:赵利、王斌、刘丽华、刘丰泽、高玉红、任雪贞、李宏博、王利民、党照、刘阳娜、袁明 璐、侯静静、孙全、张明明. ⅡNY/T４４８５—２０２５ 胡麻(油用亚麻)品种真实性鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件规定了利用简单重复序列(SimpleSequenceRepeat,SSR)分子标记法进行油用亚麻(LinuＧ musitatissimumL􀆰)品种真实性检测的总则,仪器设备、试剂和溶液配制,检测程序,鉴定意见和结果 报告. 本文件适用于胡麻(油用亚麻)品种真实性验证和真实性身份鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰１　农作物种子检验规程　总则 GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　扦样 GB/T３５４３􀆰５　农作物种子检验规程　真实性和品种纯度鉴定 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１　 品种真实性验证　varietygenuinenessverification 与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实供检样品品种名称标注是否名副其实. ３􀆰２　 品种真实性身份鉴定　varietygenuinenessidentification 经SSR分子标记检测并通过已知品种指纹数据比对平台筛查比较,确定供检样品的真实品种名称. ３􀆰３　 标准样品　standardsample 国家指定机构保存的代表品种特征特性的实物样品或DNA样品. ３􀆰４　 SSR指纹数据比对平台　SSRfingerprintblastplatform 采用SSR分子标记的标准化方法对品种标准样品等位基因进行检测,并运用计算机数据库技术和网 络信息技术所构建的审定品种分子数据信息的检索比对载体. ３􀆰５　 参照样品　referencecontrolsample 用于校准检测样品SSR等位基因已定义扩增产物片段大小的样品. ３􀆰６　 引物　primer 一条互补结合在模板DNA链上的短单链,能提供３′ＧOH末端作为DNA合成的起始点,延伸合成模 板DNA的互补链. ３􀆰７　 组合引物　panel １NY/T４４８５—２０２５ 能够组合在一起电泳的,具有不同颜色或相同颜色而扩增产物片段大小不同的荧光标记的一组引物. ３􀆰８　 等位基因　allele 在一对同源染色体上同一基因座上的一对基因. 注１:对于SSR检测,等位基因差异以扩增产物片段大小来表示. 注２:对于荧光标记引物,扩增产物片段大小是指一个已定义片段大小的区间范围,本文件将之称为Bin. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair) CI:氯仿∶异戊醇(chloroform∶３ＧMethylＧ１Ｇbutanol)(V１∶V２＝２４∶１) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyＧribonucleosidetriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis) PCI:苯酚∶氯仿∶异戊醇(phenol∶chloroform∶３ＧMethylＧ１Ｇbutanol)(V１∶V２∶V３＝２５∶２４∶１) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate) SSR:简单重复序列(simplesequencerepeat) TBE:三羟甲基氨基甲烷Ｇ硼酸盐Ｇ乙二胺四乙酸二钠(trisＧborateＧEDTA) Tris:三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase) ５　总则 胡麻的不同品种,其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单序列重复(SSR)的重复次数差异.这种 差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取DNA,用SSR引物进行扩增和电泳检测,从而通过其扩 增产物片段大小不同而加以区分品种. 依据SSR检测原理,采用固定数目的SSR引物,通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比 对的方式,对品种真实性进行验证或身份鉴定.真实性验证依据规定数目引物的SSR分子标记差异数目 而判定,品种真实性身份鉴定依据SSR分子标记数目没有差异的原则进行筛查、鉴定而确定. ６　检测方案 ６􀆰１　总则 对于品种真实性鉴定,引物、检测平台、样品状况不同,其检测结果的准确度、精确度可能有所不同. 应依据“适于检测目的”的原则,统筹考虑检测规模和检测能力,选定适宜的引物、检测平台、样品状况,制 定相应的检测方案. 在严格控制条件下,合成选择的引物,按照确定的检测平台对检测样品按DNA提取、PCR扩增、电 泳、数据分析的程序进行检测. 按规定要求填报检测结果,检验报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息. ６􀆰２　引物 ６􀆰２􀆰１　遴选了２３对SSR引物作为品种真实性验证和身份鉴定的引物,具体见表１.引物编号为FM０１~ FM２３,并据此构建了登记胡麻品种的SSR指纹数据库. ２NY/T４４８５—２０２５ 表１　引物信息 编号 引物名称 引物序列(５′Ｇ３′) 引物来源 FM０１ LGMＧ５３F:GACCTTGATCGGTGGTCAAC R:AAAGAAGAACCAGCCACAGCSotoＧCerdaetal􀆰,２０１１ FM０２ LGMＧ６１F:GCCTGCAGTTTAGTCGTTGG R:CGGAAAGAACAATTCCAGCTCSotoＧCerdaetal