2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 非 洲 菊 疫 病 抗 性 鉴 定 技 术 规 程 1 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 5 1 2 — 2 0 2 5 T e c h n i c a l c o d e o f p r a c t i c e f o r i d e n t i f i c a t i o n o f g e r b e r a r e s i s t a n c e t o p h y t o p h t h o r a b l i g h t Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４５１２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:云南省农业科学院花卉研究所、国家观赏园艺工程技术研究中心、农业农村部花卉 产品质量检验测试中心(昆明)、云南省花卉育种重点实验室、全国农业技术推广服务中心、云南省花卉标 准化技术委员会. 本文件主要起草人:杨秀梅、王丽花、张艺萍、瞿素萍、刘霞婷、王继华、许凤、张丽芳、代月星、苏艳、解 玮佳. ⅠNY/T４５１２—２０２５ 非洲菊疫病抗性鉴定技术规程 １　范围 本文件确立了非洲菊疫病抗性鉴定程序,规定了鉴定前准备、接种体制备、抗性测定、抗性评价和鉴定 后材料处理的操作指示以及转换条件,描述了相应的追溯方法. 本文件适用于非洲菊(GerberajamesoniiBolus)种质对疫病的抗性鉴定与评价. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. NY/T１５９２　非洲菊切花种苗等级规格 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 非洲菊疫病　gerberaphytophthorablight 由隐地疫霉(PhytophthoracryptogeaPethybr􀆰&Laff􀆰)侵染非洲菊引起的流行性病害. ３􀆰２ 接种体　inoculum 用于人工接种,能侵染非洲菊的隐地疫霉游动孢子悬浮液. ４　鉴定程序 包括鉴定前准备、接种体制备、抗性测定、抗性评价和鉴定后材料处理５个阶段,见图１所示. ５　鉴定 ５􀆰１　鉴定前准备 ５􀆰１􀆰１　仪器设备 超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、生物显微镜、血球计数板等. ５􀆰１􀆰２　培养基及试剂制备 ５􀆰１􀆰２􀆰１　１０％V８培养基 V８蔬菜汁１００mL、CaCO３０􀆰２g、琼脂２０g、去离子水９００mL,１２１℃高压灭菌２０min. ５􀆰１􀆰２􀆰２　１０％V８培养液 V８蔬菜汁１００mL、CaCO３１g,混匀后１５００r/min离心１０min,取上清液与去离子水按１∶９的比例 稀释,１２１℃高压灭菌２０min. ５􀆰１􀆰２􀆰３　土壤浸出液制备 取园土５００g,加入去离子水５００mL,充分搅匀后静置３h,取上清液用滤纸过滤,再经孔径０􀆰２２μm 的滤膜过滤除菌２次,滤液置于(４±１)℃冰箱保存备用. ５􀆰２　接种体制备 ５􀆰２􀆰１　病原物分离和纯化 ５􀆰２􀆰１􀆰１　病样采集 １NY/T４５１２—２０２５ 图１　非洲菊疫病抗性鉴定技术流程 采集具有典型非洲菊疫病症状(见附录A中的图A􀆰１)的病株样品,放入自封袋密封,编号后置于(４ ±１)℃冰箱保存备用. ５􀆰２􀆰１􀆰２　病样表面消毒 取病株染病叶柄基部,用自来水冲洗干净、晾干.病健交界部位宜切成０􀆰５cm×０􀆰５cm的小块,用 ７５％酒精浸２s~３s,再用２％次氯酸钠溶液浸泡３min后取出,用灭菌水清洗３次. ５􀆰２􀆰１􀆰３　病原物分离培养 在超净工作台上,将消毒好的病样接种至１０％V８平板培养基上,每皿宜接种３块,用封口膜密封后 放至２５℃~２８℃的恒温培养箱中培养５d. ５􀆰２􀆰１􀆰４　分离物纯化及鉴定 分离物的形态学特征见图A􀆰２和图A􀆰３.采用单孢分离法获得纯化菌株,确认为隐地疫霉后,科赫 法则验证菌株的致病性.将菌株接种于１０％V８平板培养基上,于２５℃~２８℃恒温培养箱中培养７d,置 于(４±１)℃冰箱保存备用. ２NY/T４５１２—２０２５ ５􀆰２􀆰２　接种体繁殖 ５􀆰２􀆰２􀆰１　菌丝丛培养 取出菌株接种至１０％V８平板培养基上,于２５℃~２８℃恒温培养箱中活化培养５d.从菌落边缘切 取大小宜为２mm×２mm的菌丝块,接种于盛有１５mL~２０mL１０％V８培养液的培养皿中,每皿接种８ 块~１０块,置于２５℃~２８℃、黑暗条件下培养３d. ５􀆰２􀆰２􀆰２　孢子囊诱导 菌丝丛形成后,去除培养液,加入１５mL~２０mL灭菌自来水重新悬浮培养菌丝丛.每皿滴加土 壤浸出液３滴~５滴,置于２５℃~２８℃、黑暗条件下培养３d~５d,每隔１２h~２４h换一次水并滴加土 壤浸出液. ５􀆰２􀆰２􀆰３　游动孢子悬浮液制备 将产生大量孢子囊的菌丝丛挑入盛有１０mL灭菌自来水的培养皿中,置于５℃~１０℃冰箱中 １５min,取出于２０℃~２６℃下放置３０min,待大量游动孢子释放时,采用血球计数板计数,将游动孢子悬 浮液的浓度调至(１􀆰０~１􀆰５)×１０４个/mL. ５􀆰３　抗性测定 ５􀆰３􀆰１　温室条件 温度１５℃~３０℃、光照２０klx~５０klx. ５􀆰３􀆰２　材料准备 ５􀆰３􀆰２􀆰１　对照材料 以病情指数DI≤１０的品种为抗病对照品种,以病情指数DI＞５０的品种为感病对照品种.病情指 数按照附录B中的B􀆰１计算. ５􀆰３􀆰２􀆰２　待测材料 应符合NY/T１５９２优级苗的规定.每份材料设３个重复,每重复不低于３０株,随机排列. ５􀆰３􀆰３　定植 按以下操作: a)　栽培基质宜选用泥炭和园土,按１∶３(V/V)混合; b)基质宜采用蒸汽高温消毒,９０℃~１０５℃保持３０min; c)选用口径１０cm~１５cm的花盆,种植１株/盆,栽植深度２cm~３cm,定植后浇一次透水; d)白天为２０℃~２５℃,夜间为１５℃~２０℃. ５􀆰３􀆰４　接种 ５􀆰３􀆰４􀆰１　接种时期 定植后第１１d~１５d. ５􀆰３􀆰４􀆰２　接种方法 接种前１d植株浇透水.用移液器吸取５􀆰２􀆰２􀆰３制备的游动孢子悬浮液,沿茎基部灌注至根际土壤 中,每株４mL.接种后用塑料薄膜覆盖植株,保湿４８h. ５􀆰３􀆰４􀆰３　接种后管理 置于２５℃~３０℃、光照１２h~１４h、强度３０klx~４０klx的温室中,保持土壤最大持水量的６０％~ ７０％. ５􀆰３􀆰５　病情调查 ５􀆰３􀆰５􀆰１　调查时间 接种后１５d~２０d调查病情.当感病对照品种的病情指数DI＞５０时,调查时间可适当调整. ５􀆰３􀆰５􀆰２　病情级别划分 按照附录B中的B􀆰２和B􀆰３划分病情级别. ５􀆰３􀆰５􀆰３　调查方法 ３NY/T４５１２—２０２５ 根据病情级别划分调查每份鉴定材料的发病情况,记载单株病情级别. ５􀆰３􀆰５􀆰４　病情指数计算 计算每份鉴定材料的病情指数,结果取３次重复的平均值. ５􀆰４　抗性评价 ５􀆰４􀆰１　鉴定结果有效性判别 当对照材料达到相应的病情指数,且与实际抗性程度相符,判定该批次抗性鉴定有效. ５􀆰４􀆰２　抗性评价要求 根据鉴定材料病情指数的平均值确定其抗性水平,评价要求见表１. 表１　非洲菊疫病抗性评价要求 病情指数(DI) 抗性评价(级别) ０＜DI≤１０ 高抗(HR) １０＜DI≤２５ 抗病(R) ２５＜DI≤５０ 中抗(MR) ５０＜DI≤８０ 感病(S) DI＞８０ 高感(HS) ５􀆰４􀆰３　鉴定结果记录 按照附录C记录. ５􀆰５　鉴定后材料处理 处理方式如下: a)　鉴定完毕后集中焚烧所有植物材料; b)基质宜采用蒸汽高温消毒处理,９０℃~１０５℃保持３０min; c)病原培养物、接种体宜采用高压蒸汽灭菌,１２１℃保持６０min. ６　追溯方法 应记录培养基及试剂制备、接种体制备、抗性测定等阶段的具体方法和过程内容,保留病情调查、抗性 评价等数据,保存时间不少于２４个月.宜采用信息化技术手段管理相关记录和档案,以便于追溯.具体 包括: a)　病样采集时间、地点、品种、症状记录及照片; b)培养基制备方法和过程记录; c)病原物分离纯化、接种体繁殖方法和过程记录; d)植物材料定植、接种方法和过程记录; e)病情调查、抗性评价数据记录和存档等. ４NY/T４５１２—２０２５ 附　录　A (资料性) 非洲菊疫病症状、病原菌分类地位、形态特征及传播途径 　 A􀆰１　症状 病原菌从近地面茎基部侵染,向下延伸到根部.发病初期地上部分失水卷曲、萎蔫,易拔起.受害植 株根部或叶柄基部变软、水浸状,严重时呈黑褐色、皮层脱落(见图A􀆰１).湿度大时,病部表面长出稀疏的 白色霉状物,即病原菌的菌丝体、孢囊梗和孢子囊. 图A􀆰１　非洲菊疫病症状 A􀆰２　病原菌分类地位 隐地疫霉(P􀆰cryptogeaPethybr􀆰&Laff􀆰)属藻界(Chromistan)卵菌门(Oomycota)卵菌纲(OomyＧ cetes)霜霉目(Peronosporales)霜霉科(Peronosporaceae)疫霉属(Phytophthor