2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 苏 云 金 芽 胞 杆 菌 农 药 制 剂 参 照 样 品 的 制 备 和 定 值 指 南 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 0 0 . 1 0 C C S B 4 5 8 6 — 2 0 2 5 G u i d e l i n e f o r p r e p a r a t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o f B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s p e s t i c i d e r e f e r e n c e m a t e r i a l s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４５８６—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:中国农业科学院植物保护研究所、武汉科诺生物科技股份有限公司、农业农村部农 药检定所、华中农业大学、湖北省生物农药工程研究中心、扬州绿源生物化工有限公司、全国农业技术推广 服务中心. 本文件主要起草人:张杰、束长龙、耿丽丽、刘华梅、刘荷梅、张宏军、孙明、王开梅、徐健、卓富彦. ⅠNY/T４５８６—２０２５ 苏云金芽胞杆菌农药制剂参照样品的制备和定值指南 １　范围 本文件提供了苏云金芽胞杆菌农药制剂参照样品的分类、制备、定值、包装、证书、标签、质量保证期和 储运等指南. 本文件适用于以产品毒力效价或杀虫蛋白为特性值的苏云金芽胞杆菌农药制剂参照样品的制备和定 值.球形芽胞杆菌产品也可参照执行. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB３７９６　农药包装通则 GB４７８９􀆰１５—２０１６　食品安全国家标准　食品微生物学检验　霉菌和酵母计数 GB/T１５０００􀆰３　标准样品工作导则　第３部分:标准样品定值和均匀性与稳定性评价 GB/T１５０００􀆰４　标准样品工作导则　第４部分:证书、标签和附带文件的内容 GB/T１５０００􀆰６　标准样品工作导则　第６部分:标准样品包装通则 GB/T１５０００􀆰７　标准样品工作导则　第７部分:标准样品生产者能力的通用要求 GB/T１９５６７􀆰１—２００４　苏云金芽胞杆菌原粉 GB/T３０３６１—２０１３　农药干燥减量的测定方法 JJF１３４３　标准物质的定值及均匀性、稳定性评估 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 苏云金芽胞杆菌参照样品　Bacillusthuringiensisreferencematerials 有定量毒力效价或杀虫蛋白、均匀稳定的苏云金芽胞杆菌参考品. 注:适用于苏云金芽胞杆菌的不同菌株,通过毒力效价或杀虫蛋白定值的产品. ３􀆰２ 均匀性　homogeneity 参照样品的基本属性,包括单元内和单元间均匀性,其毒力效价或杀虫蛋白保持在规定的限值范围内. ３􀆰３ 稳定性　stability 参照样品在规定的条件下储存,在规定的时间内,其毒力效价或杀虫蛋白保持在规定的限值范围内. ３􀆰４ 质量保证期　qualityassuranceperiod 在规定的条件下储存时,能作为参照样品使用的最终有效日期. ３􀆰５ 参照样品的生产者　referencematerialproducers;RMP 技术上有能力的机构(公立或私营的组织或公司),对其参照样品生产的项目策划和管理、毒力效价和 杀虫蛋白的定值、标签负全部责任. １NY/T４５８６—２０２５ ３􀆰６ 特性值　propertyvalue 参照样品的物理、化学、生物学等特性值. ３􀆰７ 定值　characterization 对参照样品特性值的测定. ３􀆰８ 计量溯源性　metrologicaltraceability 是确保测量结果能够在不同时间与空间保持可比的关键. ４　参照样品的分类 按参照样品杀虫蛋白分子量和靶标害虫,苏云金芽胞杆菌参照样品分为杀虫蛋白参照样品和毒力效 价参照样品. ５　参照样品的制备 ５􀆰１　原料选择 选择不含干扰性杂质、有足够稳定性和高度特异性、质量符合GB/T１９５６７􀆰１—２００４要求的苏云金杆 菌原粉,制备参照样品可参考附录A. ５􀆰２　生产者能力要求 生产者能力除应达到GB/T１５０００􀆰７的有关要求外,还应具备: a)　能生产或获取与供试品同菌株的合格原粉; b)　毒力效价参照样品生产者具备附录A要求的加工能力; ５􀆰３　参照样品的制备步骤 ５􀆰３􀆰１　将苏云金芽胞杆菌原粉约３kg,装入铝箔袋中密封,２０℃~２５℃储存一年. ５􀆰３􀆰２　取上述储存后的苏云金芽胞杆菌原粉,参照附录A制备样品. ５􀆰３􀆰３　检测制备好的参照样品,质量指标与检测方法见表１. 表１　参照样品质量指标 项目 指标 检测方法 粒径 D５０≤２５μm、D９０≤５０μm 激光粒度仪干法 干燥减量 ≤６％ GB/T３０３６１—２０１３中２􀆰１ 霉菌 ≤１００个/g GB４７８９􀆰１５—２０１６第一法 ５􀆰３􀆰４　经检测合格的样品分装入自封袋中,于－２０℃~－１８℃冷冻室储存,进行均匀性和稳定性评价、 定值. ５􀆰４　均匀性检验 按５􀆰３制备的毒力效价参照样品无需进行均匀性检验,杀虫蛋白参照样品应按照GB/T１５０００􀆰３设 计和开展均匀性检验,检测方法参照附录B.当参照样品的不均匀性误差和测量方法的随机误差无显著 差异,则认为参照样品均匀性良好. ５􀆰５　稳定性检验 ５􀆰５􀆰１　参照样品均匀性检验合格后,应按照GB/T１５０００􀆰３设计和开展稳定性检验.包括常温、低温稳 定性和长期稳定性检验,也可根据参照样品特性及特殊用途开展其他温度的稳定性试验. ５􀆰５􀆰２　常温储存稳定性试验温度为２０℃~２５℃,时长为２个月,至少检测５次. ５􀆰５􀆰３　低温储存稳定性试验温度为０℃~５℃,时长为１年~２年. ５􀆰５􀆰４　长期稳定性试验温度为－２０℃~－１８℃,时长至少２年,第一年每３个月检验一次,之后每１２个 ２NY/T４５８６—２０２５ 月检验一次,每次检验样品数不少于２个. ５􀆰５􀆰５　杀虫蛋白检验可参照附录B;毒力效价检测选择对产品敏感的靶标害虫和对应的检测方法. ６　参照样品的定值 ６􀆰１　总则 对均匀性和稳定性试验评价符合要求的参照样品进行定值.根据苏云金芽胞杆菌特殊的理化性质, 采用SDSＧPAGE法对杀虫蛋白进行定值,采用生物测定法毒力效价进行定值. ６􀆰２　杀虫蛋白的定值 参照样品生产者可参照附录B方法进行杀虫蛋白的定值,也可委托具有GB/T１５０００􀆰７所要求能力 的机构定值,定值的结果和过程可溯源.检测报告内容应包括但不限于样品相关信息、检验依据、参照样 品的标准值及不确定度.定值结果和不确定度的表示可按照JJF１３４３的规定执行. ６􀆰３　毒力效价的定值 ６􀆰３􀆰１　计量溯源性原则 ６􀆰３􀆰１􀆰１　苏云金芽胞杆菌参照样品的毒力效价定值,应选用目前市面同菌株可追溯对照样品或以其定值 的参照样品; ６􀆰３􀆰１􀆰２　新菌株新靶标参照样品,首次可对毒力效价进行赋值,赋值原则是有利于质量评价和使用指导. 一旦首次赋值,以后制备同质参照样品的毒力效价的定值,应遵循计量溯源性原则. ６􀆰３􀆰２　定值方式的选择 ６􀆰３􀆰２􀆰１　委托２个以上的有相关检测能力和经验的实验室,采用统一的检测方法进行定值. ６􀆰３􀆰２􀆰２　各实验室应充分沟通试验方法可行性、靶标来源、饲养情况、供试虫龄期和生理状态、检测用参 照样品等信息,不同靶标害虫的毒力效价检测应建立可行的检测方法,确保检测方法的一致性. ６􀆰３􀆰３　数据统计处理及定值 ６􀆰３􀆰３􀆰１　毒力效价测定结果,用格拉布斯(Grubbs)或狄克逊(Dixon)法检验临界值,剔除可疑值,然后进 行正态性检验,数据应符合正态分布. ６􀆰３􀆰３􀆰２　对不同实验室测定的毒力效价的平均值和标准偏差分别进行差异显著性分析. ６􀆰３􀆰３􀆰３　若检验结果没有显著性差异,数据合并给出总体平均值和标准偏差;若差异显著,应检查检测方 法、条件及操作过程,改进后重新进行测定. ６􀆰３􀆰３􀆰４　定值结果和不确定度的表示按照JJF１３４３的规定执行. ６􀆰３􀆰４　参照样品合格认定 均匀性和稳定性符合要求且定值的样品,作为特定靶标害虫的苏云金芽胞杆菌毒力效价和(或)杀虫 蛋白参照样品. ７　包装、证书、标签、质量保证期和储运 ７􀆰１　包装和标签 ７􀆰１􀆰１　苏云金芽胞杆菌类农药制剂参照样品的包装应符合GB３７９６和GB/T１５０００􀆰６的要求.参照样 品包装宜采用抗压、性能稳定的５mL圆底冻存管,外套铝箔袋. ７􀆰１􀆰２　参照样品标签按照GB/T１５０００􀆰４的内容要求编写,说明书应包括参照样品信息、定值信息、储存 条件、不同储存条件下的质量保证期等. ７􀆰２　储运 参照样品的储存条件依据储存目的,按说明书中对应要求执行.参照样品运输过程应保持阴凉干燥, 确保包装不破损、无污染. ３NY/T４５８６—２０２５ 附　录　A (资料性)