2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 农 药 神 经 毒 性 试 验 指 南 1 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 5 9 6 — 2 0 2 5 G u i d a n c e o n n e u r o t o x i c i t y s t u d y o f p e s t i c i d e Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４５９６—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:农业农村部农药检定所. 本文件主要起草人:闫长会、刘然、张丽英、陶岭梅、陶传江、吴纯启、关勇彪、于雪骊. ⅠNY/T４５９６—２０２５ 　 　 　农药神经毒性试验指南 １　范围 本文件确立了农药神经毒性试验的基本原则、方法和要求,并界定了相关术语和定义. 本文件适用于为农药登记而进行的神经毒性试验. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB１４９２５　实验动物　环境及设施 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 毒副作用　adverseeffect 任何处理引起的机体生存、生育或环境适应能力减弱或降低的变化. ３􀆰２ 剂量　dose 所给受试物的量,以实验动物单位体重所接受受试物的质量(mg/kg体重)或染毒用的饲料中受试物 的浓度(mg/kg饲料)表示. ３􀆰３ 给药量　dosage 由染毒剂量、染毒频率和染毒期限所组成的术语. ３􀆰４ 神经毒性　neurotoxicity 由于接触化学、生物或物理因素而产生的神经系统结构或功能的有害变化. ３􀆰５ 神经毒物　neurotoxicant 能够诱发神经毒性的任何化学、生物或物理因素. ３􀆰６ 未观察到有害作用剂量水平　noobservedadverseeffectlevel,NOAEL 在规定的试验条件下,用现有技术手段和检测指标,未观察到与染毒有关的有害效应的受试物最高剂 量或浓度. ４　试验概述 实验动物分为若干个剂量组,各组动物每天经口染毒一定剂量的受试物,连续染毒２８d、９０d、１年或 更长时间.实验动物在每个观察周期进行临床观察和功能测试,试验结束时对各组中２种性别的动物进 行灌流固定,对大脑、脊髓以及外周神经等组织器官进行组织病理学检查.本试验指南同样适用于急性神 经毒性试验. 当单独进行神经毒性的筛检试验时,不做灌流固定及组织病理学检查的各组动物(见附录A)可用于 １NY/T４５９６—２０２５ 特殊的神经行为、神经病理、神经化学或电生理的检查,从而补充相关神经毒性资料. 当本试验与其他毒性试验结合进行时,需要有足够动物的数量,以满足两个试验的需要. ５　试验方法 ５􀆰１　试验动物 ５􀆰１􀆰１　动物品系的选择 实验动物首选大鼠,使用其他动物应说明理由.选用常用动物品系的健康动物,雌性动物应使用未生 育过和未受孕的.一般断乳后即开始染毒,染毒开始时,动物不超过６周龄.若与其他毒性试验合并进行 时,对鼠龄的要求可适当调整(一般不迟于９周龄).在试验开始时同一性别动物体重变化范围不应超过 平均体重的２０％.当短期重复染毒毒性试验作为长期毒性试验的预试验时,预试验与长期试验所用动物 的品系要一致. ５􀆰１􀆰２　数量与性别 每个剂量组或对照组至少２０只动物(雌雄各半),进行临床观察和功能测试.试验结束时,每组每性 别至少５只动物进行灌流固定,用作神经系统组织病理学检查.当某个剂量组仅个别动物出现神经毒性 改变时,必须选取该动物灌流固定进行组织病理学检查.当与重复染毒毒性试验合并进行时,动物数量应 满足２个试验的需要,每组所需的最少动物数见附录A.如果设有中期处死或恢复期组观察毒效应的可 恢复性、持久性或迟发性毒性时,应增加动物数量,以确保用于组织病理观察的动物数. ５􀆰１􀆰３　饲养条件 动物饲养条件应符合GB１４９２５的有关规定.在染毒前和染毒后,动物按性别及剂量分笼饲养,每笼 的动物数以不干扰对每只动物的观察为宜. ５􀆰１􀆰４　实验动物准备 染毒开始前,动物饲养观察至少５d以适应实验室环境.动物按体重随机分组编号,每只动物单独编 号.在开始染毒前,将动物随机分配到各染毒组和对照组中.笼具的安放应尽量减少对试验的影响. ５􀆰２　受试物配制 如果受试物不能使用原液,应优先使用水溶液或水混悬液,其次可考虑使用油溶液(如玉米油)或油混 悬液,最后考虑使用其他溶媒制成溶液或混悬液.溶媒本身应无毒、不与受试物产生化学反应且不影响受 试物的吸收. ５􀆰３　剂量及分组 通常选用至少３个染毒剂量组和１个对照组.一般各剂量组间相差２倍~３倍(若各剂量组间相差 １０倍以上,则需要添加第４个染毒剂量组).原则上高剂量组动物应出现神经毒效应或明显系统毒性,低 剂量组应不引起神经毒效应或系统毒性,中剂量组可产生的轻度神经毒效应或系统毒性.如果已有毒性 资料表明１０００mg/kg体重剂量不会诱发毒效应,可减少剂量组数.对于单次经口染毒,限度试验的剂量 水平至少应达到２０００mg/kg体重.如果没有合适的参考剂量,可进行剂量探索的预试验,以便确定染毒 剂量.对照组动物除不给予受试物处理外,其他处理条件应与染毒组动物相同.如果在染毒时使用赋形 剂,赋形剂对照组溶剂体积应该与最高染毒剂量组一致.如溶剂毒性已知,可仅设溶剂对照组,否则应增 设空白对照组. ５􀆰４　试验步骤 ５􀆰４􀆰１　染毒途径 推荐经口染毒途径,如灌胃、拌饲、拌水.也可选择其他染毒途径(如经皮或吸入染毒),染毒途径的选 择取决于人体接触受试物的方式、现有毒理学或毒代动力学资料. ５􀆰４􀆰２　染毒频率与期限 急性神经毒性试验采用单次染毒,若单次染毒无法满足染毒剂量需要时,可在２４h内多次染毒. 重复染毒毒性试验中,动物应每天染毒,每周染毒７d,至少连续染毒２８d.灌胃采用灌胃针或套管每 天单次染毒,一次染毒体积原则上不超过１０mL/kg体重,但对于水溶液,可增大至２０mL/kg体重.除 ２NY/T４５９６—２０２５ 了刺激性和腐蚀性受试物,其他受试物均要通过调整浓度,使各剂量组动物染毒体积的差别最小,尽量保 证各剂量组等体积染毒.当受试物拌饲或拌水染毒时,受试物的含量不能干扰动物正常摄食与饮水.可 采用恒定的受试物饲料浓度(mg/kg饲料)或以动物体重为单位[mg/(kg􀅰d)]的一致剂量进行染毒;如 采用其他剂量单位的染毒方法时应加以说明. ５􀆰４􀆰３　观察频率与期限 急性神经毒性试验染毒后连续观察１４d.重复染毒毒性试验中,整个染毒期间均需进行观察. 在染毒后出现预期毒效应的高峰期进行观察,且每天在同一时间范围内进行观察.临床观察和功能 测试的频率见附录B.如实际试验中需要有不同时间点的观察、测试或采用不同的染毒观察时间,允许改 变观察时间表并说明理由. 所有动物的一般健康情况检查每天至少１次,对于发病或濒死动物,每天至少检查２次. ５􀆰４􀆰４　详细临床观察 首次染毒前,应对所有受试动物进行详细临床观察(见附录A),并根据试验周期(见附录B)按不同时 间间隔进行观察. 详细临床观察应在动物笼外操作台上进行,每天在同一时间进行.详细记录所观察到的改变,按照实 验室制定的统一标准对各指标进行打分.建议按照盲法操作,避免系统误差. 观察的指标应包括但不限于以下方面的改变:皮肤、被毛、眼睛、黏膜、口鼻分泌物情况、尿粪排泄情 况、自主神经活动(如流泪、竖毛、瞳孔大小、呼吸类型异常、尿粪排泄异常和尿液颜色异常等).应观察记 录体位异常变化、活动量(如旷场地内探索反应的增加或减少)及运动的协调性、步态变化(如步态蹒跚、共 济失调等)、姿势(如弓形背)、对抓取或外来刺激的反应状况、阵孪性或强直性活动、抽搐或震颤、刻板运动 (如过度梳理、头部异常活动、重复的转圈活动等)、行为异常(如咬啃或过度舔、自残、后退、异常发声等)或 攻击行为等.可通过动物的功能组合试验(FOB)进行观察(见附录C). ５􀆰４􀆰５　功能测试 功能测试与详细临床观察频率一致,染毒前需测试１次(见附录A).除了附录A所述的观察周期 外,也应在处死前对观察恢复期的动物进行同样的功能测试. 功能测试项目应包括:运动功能(常用试验方法有自发行为测试、肢体抓力、转棒协调试验、步态分析 试验等),对不同刺激(如听觉、视觉和本体感受器的刺激)的感觉反应(常用试验方法有甩尾试验、眼刺激 试验、躯体感觉测试等).如果有其他资料(如构效关系、流行病学资料及其他毒理学研究资料等)提示受 试物存在潜在神经毒性效应,应考虑追加感觉和运动功能或学习记忆测试(如主动回避试验、被动回避试 验、位置偏爱试验、Morris水迷宫试验等). 对于出现毒性表现但干扰功能测试结果的动物可以不进行上述测试,但需说明理由. ５􀆰４􀆰６　体重、摄食量及饮水量测定 急性神经毒性试验应分别在染毒前、染毒后(每周一次)和处死前对全部动物称量并记录体重. 在染毒周期不长于９０d(包括９０d)的毒性