2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 蜂 王 浆 中 酮 胺 类 糖 化 蛋 白 的 测 定 分 光 光 度 法 4 7 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 4 0 C C S B 4 6 4 2 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f k e t o - a m i n e g l y c o s y l a t e d p r o t e i n s i n r o y a l j e l l y — S p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６４２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和编写起草规则»的规 定起草. 请注意本文件某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC２７４)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院蜜蜂研究所、江苏蜂奥生物科技有限公司、广西梧州甜蜜家蜂业有 限公司、上海森蜂园蜂业有限公司. 本文件主要起草人:张红城、张勇、乔江涛、黄忠连、于富民、孔令杰、董捷. ⅠNY/T４６４２—２０２５ 蜂王浆中酮胺类糖化蛋白的测定　分光光度法 １　范围 本文件描述了蜂王浆中酮胺类糖化蛋白含量测定的分光光度法. 本文件适用于蜂王浆中酮胺类糖化蛋白的测定. 本文件方法的检出限为３mg/g,定量限为１０mg/g. 注:结果以蜂王浆蛋白中所含１Ｇ脱氧Ｇ１Ｇ吗啉ＧDＧ果糖(DMF)的质量计. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB９６９７—２００８　蜂王浆 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 酮胺类糖化蛋白　ketoＧamineglycosylatedproteins 具有酮胺类结构的糖化蛋白. 注:在蜂王浆中一般由还原糖通过非酶促褐变与蛋白质产生醛亚胺,再通过amadori重排反应形成酮胺类糖化蛋白, 其酮胺类结构与DMF一致. ４　原理 试样中酮胺类糖化蛋白在碱性条件下还原氯化硝基四氮唑蓝(NBT),生成蓝紫色甲臜类化合物,在 ５３０nm处有最大吸收.吸光度与酮胺类糖化蛋白成正比,根据DMF标准曲线,计算蜂王浆蛋白质中酮 胺类糖化蛋白的含量. ５　试剂或材料 除非另有说明,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２,三级水. ５􀆰２　碳酸盐缓冲液(０􀆰１mol/L,pH１０􀆰８):准确称取无水碳酸钠９􀆰４５g、碳酸氢钠０􀆰８４g于１０００mL烧 杯中,用水溶解定容至１０００mL容量瓶中,于２℃~８℃保存,有效期３个月. ５􀆰３　TritonXＧ１００溶液(０􀆰０２％pH１０􀆰８):准确量取１mLTritonXＧ１００(３０％)溶液于烧杯中,用碳酸盐 缓冲液(５􀆰２)稀释成１５００mL.现配现用. ５􀆰４　DMF标准储备溶液(６mmol/L):准确称取３７􀆰４０mg的DMF(CAS号:６２９１Ｇ１６Ｇ３,纯度≥９８％)于 ２５mL容量瓶中,用水溶解定容,于２℃~８℃保存,有效期３个月. ５􀆰５　NBT储备溶液(０􀆰５mmol/L,pH１０􀆰８):准确称取１０２􀆰２０mg的NBT于２５０mL容量瓶中,用碳酸 盐缓冲液(５􀆰２)溶解并定容,在２℃~８℃条件下储存于棕色瓶中,有效期３个月. ５􀆰６　标准系列溶液:分别取DMF标准储备溶液(５􀆰４)０μL、２０μL、５０μL、１００μL、１５０μL、２００μL至６支 试管中,用水补足至１０００μL.配制成DMF浓度分别为０mmol/L、０􀆰１２mmol/L、０􀆰３mmol/L、 １NY/T４６４２—２０２５ ０􀆰６mmol/L、０􀆰９mmol/L、１􀆰２mmol/L的标准系列溶液. ６　仪器设备 ６􀆰１　分光光度计:精度±２nm. ６􀆰２　恒温水浴锅:精度±１℃. ６􀆰３　分析天平:感量０􀆰０１g和０􀆰０１mg. ６􀆰４　涡旋混匀器. ７　样品 将蜂王浆充分搅拌均匀;对于冷冻的供试样品,在２５℃下完全解冻后,搅拌均匀.分出约５０g作为 试料,置于样品瓶中,密封,并标明标记. 取样后应立即试验.如不能及时试验,应在－１８℃冰箱中冷冻保存. ８　试验步骤 ８􀆰１　蜂王浆中蛋白质含量测定 按GB９６９７—２００８中５􀆰４的规定测定蜂王浆中蛋白质含量的质量分数. ８􀆰２　试样溶液制备 平行做两份试验.试样解冻至２５℃,用玻璃棒搅拌均匀,准确称取１g(精确至０􀆰０１g)样品,用水充 分溶解并定容至２００mL,待测. ８􀆰３　标准曲线的绘制 分别取系列标准溶液(５􀆰６)各１００μL于６支１０mL试管中,再分别加入２mL５７℃预热的NBT (５􀆰５)和２mLTritonXＧ１００溶液(５􀆰３),涡旋混匀.于５７℃水浴中反应２０min,以标准曲线０mmol/L为 空白,在５３０nm波长下测定其吸光度.以DMF浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线. ８􀆰４　空白试样溶液制备 精密吸取１００μL试样(８􀆰２)至１０mL试管中,加入２mL５７℃预热的水和２mLTritonXＧ１００溶液 (５􀆰３)涡旋混匀,于５７℃水浴２０min. ８􀆰５　试样测定 精密吸取１００μL试样(８􀆰２)至１０mL试管中,分别加入２mL５７℃预热的NBT(５􀆰５)和２mLTriton XＧ１００溶液(５􀆰３)涡旋混匀.于５７℃水浴中反应２０min,以空白试样溶液(８􀆰４)为参比,在５３０nm波长处 测定吸光度. ９　试验数据处理 试样中酮胺类糖化蛋白的含量以蜂王浆蛋白中所含DMF的质量计,以w(mg/g)表示,结果按公式 (１)计算. w＝c×V×２４９􀆰２６ m×Ω(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: c　　　———通过DMF标准曲线计算所得待测样对应的DMF的浓度,单位为毫摩尔每升(mmol/ L); V ———试样定容体积,单位为升(L); ２４９􀆰２６———DMF的摩尔质量,单位为每摩尔(g/mol); m ———试样的质量,单位为克(g); Ω ———蜂王浆中蛋白质质量分数,单位为百分号(％); 测定结果以平行测定的算术平均值表示,保留３位有效数字. ２NY/T４６４２—２０２５ １０　精密度 在重复性条件下,两次独立测定结果与其算数平均求的绝对差值不大于算求平均值的１０％. ３