2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 动 物 源 性 食 品 中 裂 头 蚴 检 测 方 法 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 4 6 5 5 — 2 0 2 5 D e t e c t i o n m e t h o d s f o r p l e r o c e r c o i d l a r v a e o f S p i r o m e t r a s p p . i n a n i m a l - d e r i v e d f o o d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６５５—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院上海兽医研究所. 本文件主要起草人:陈兆国、米荣升、龚海燕、黄燕、张晓丽、张艳. ⅠNY/T４６５５—２０２５ 引　　言 迭宫绦虫(Spirometraspp􀆰)隶属于绦虫纲(Cestoda)双叶槽科(Diphyllobothriidae,也称裂头科),呈 世界性分布,亚洲尤其中国多见.其幼虫裂头蚴[sparganum,也称实尾蚴(plerocercoid)]可寄生于鱼、蛇、 蛙、鸡,以及哺乳动物猪等动物体内,引起食欲不振、皮肤发痒、脱毛、消瘦、生长缓慢等症状,影响动物源性 食品的质量和安全.但寄生于不同动物体内的裂头蚴大小、形态差异较大,临床症状常不典型或不明显. ⅡNY/T４６５５—２０２５ 动物源性食品中裂头蚴检测方法 １　范围 本文件规定了动物组织或肉及肉制品中迭宫绦虫裂头蚴目检、显微镜检和PCR检测方法的技术要求. 本文件适用猪、鸡、蛙、鱼等动物的产品及其制品中迭宫绦虫裂头蚴的检测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. cox１:线粒体细胞色素c氧化酶亚基１(Mitochondrialcytochromecoxidasesubunit１)基因 DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid) EB:溴化乙锭(EthidiumBromide) PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline) PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction) TAE:TrisＧ乙酸电泳缓冲液(TrisAcetateＧEDTABuffer) ５　样品的采集、保存和运输 ５􀆰１　样品的采集 ５􀆰１􀆰１　总则 根据不同动物的具体情况,每头动物采集胴体一个部位或多个部位的肌肉或组织,或者肉制品中的肌 肉或组织.对小型食用动物,也可直接采集活动物. ５􀆰１􀆰２　猪 采集腹膜下板脂,膈肌脚、腹壁肌、胸肌、腰肌、肾周围连接脂肪的肌肉组织,尤其是皮下、腹膜下、腹壁 肌肉及股部肌肉结缔组织中含有的外观似脂肪、呈蜷曲状、绿豆至黄豆大小、乳白色或略带黄色、筋膜样长 线条状的组织,以及出血部位的肌肉组织,每份样品不少于１００g. ５􀆰１􀆰３　鸡 采集腹部、股部、胸部、嗉囊周围的皮下和胸大肌,尤其肌胃外围脂肪、腺胃和嗉囊外围浆膜下含有的 外观似脂肪、呈蜷曲状、绿豆至黄豆大小、乳白色或略带黄色、筋膜样长线条状的组织,每份样品不少于 １００g;或随机选取２０只~３０只活鸡. ５􀆰１􀆰４　蛙 采集后腿、前腿、背部、胸腹部肌肉,体腔,皮下组织(尤其背部)中含有的外观似脂肪、呈蜷曲状、绿豆 至黄豆大小、乳白色或略带黄色、筋膜样长线条状的组织,每份样品不少于１００g;或随机选取２０只~３０ 只活蛙. １NY/T４６５５—２０２５ ５􀆰１􀆰５　鱼 采集体表、鳞和鳍,以及腹壁肌肉、腹腔表面含有的外观似脂肪、蜷曲状、绿豆至黄豆大小、乳白色或略 带黄色、筋膜样长线条状的组织;或取肌肉样品,每份不少于１００g;或按动物数量随机选取２０尾~３０尾 活鱼. ５􀆰２　样品的运输和保存 ５􀆰２􀆰１　样品应尽快送到检测实验室,一般不应超过２４h.特殊情况可根据被检测对象的要求和送样运 输的要求做相应处理,如加入保护剂,将样品放入带有冰块或干冰的冰壶、泡沫塑料隔热箱内等. ５􀆰２􀆰２　样品送往实验室时,应填报送检单.送检单内容包括送检单位(送检人)、送检日期、样品名称、采 样部位、数量、来源、有关货主的信息(编号、姓名、地址、联系方法等)、要求检测的项目等. ５􀆰２􀆰３　检测实验室在接到样品和采样报告单时,应立即登记,填写实验序号. ５􀆰２􀆰４　采集的样品,当天检查的,存放于２℃~８℃条件下;１月以内检查的,存放于－２０℃,疑似虫体亦 可保存于７０％酒精中;超过１个月的,存放于－８０℃冰箱,疑似虫体亦可保存于７０％酒精中. ６　目检法 ６􀆰１　主要仪器设备 ６􀆰１􀆰１　外科手术剪. ６􀆰１􀆰２　不锈钢镊子. ６􀆰１􀆰３　不锈钢、铝合金或塑料肉样盘:内有格子并编号. ６􀆰１􀆰４　尺子:最小刻度０􀆰１cm. ６􀆰２　检查方法 仔细观察５􀆰１采集的组织样品或活动物相应的组织样品中,是否存在外观似脂肪、呈蜷曲状、绿豆至 黄豆大小的组织,进一步观察是否呈乳白色或略带黄色、筋膜样长线条状,将这些组织用剪刀仔细挑出,观 察其形态、测量其大小. ６􀆰３　结果判定 若发现存在乳白色或淡黄色,长带形,呈白棉线状,长０􀆰５cm~８０􀆰０cm,宽０􀆰１cm~１􀆰０cm;头端膨 大,呈匙状,顶端中央有一孔向内凹陷;虫体不分节,体表具有不规则的横纹;末端钝圆;刚采集时不断蠕动 (图例见附录A中的图A􀆰１和图A􀆰２).一份样品中任一部位发现有类似上述裂头蚴或残断裂头蚴,可判 定为迭宫绦虫裂头蚴疑似感染.若样品各部位均未发现上述裂头蚴或者裂头蚴的残断体,则判定为阴性. 疑似虫体及残断虫体的鉴定,需采用显微镜检法或PCR方法检测确诊. ７　显微镜检法 ７􀆰１　主要仪器及材料 ７􀆰１􀆰１　外科手术剪. ７􀆰１􀆰２　不锈钢镊子. ７􀆰１􀆰３　不锈钢、铝合金或塑料肉样盘:内有格子并编号. ７􀆰１􀆰４　载玻片. ７􀆰１􀆰５　注射器针头:４􀆰５号或５号,市售商品. ７􀆰１􀆰６　体视显微镜或生物显微镜. ７􀆰２　试剂 生理盐水,按照附录B中B􀆰１描述的方法配制. ７􀆰３　操作方法 目检法发现的疑似裂头蚴虫体或裂头蚴残断体样品,可采用显微镜检法确诊.将疑似裂头蚴虫体、疑 似裂头蚴残断体、组织置于载玻片上,滴加适量生理盐水,放置在体视显微镜或生物显微镜下,低倍(０􀆰５× ２NY/T４６５５—２０２５ １０~１０×１０)下观察虫体外部形态和内部结构.再用注射器针头的针尖划破虫体,高倍(４０×１０)下观察从 破损处流出的组织类型. ７􀆰４　结果判定 若发现存在大小、颜色和形态同６􀆰３描述的疑似虫体,体视显微镜下观察,疑似虫体顶端中央有一明 显向内凹陷,呈隧道状,并向后延伸形成盲管;生物显微镜下观察,疑似虫体的前端背腹各有１条纵行的吸 槽,虫体不分节,体表有凹凸不均的横皱褶,尾部钝圆;虫体内实质呈网状结构,无器官和空腔结构,调整焦 距,出现数目较多的圆形或不规则的石灰小体,或存在排泄小管;用针头划破虫体后,在４０×１０倍显微镜 下有折光性强、无细胞结构、比裂头蚴体细胞大、呈圆形或椭圆形盘状物的石灰小体流出,可判定为裂头蚴 阳性.若样品中未发现上述形态的裂头蚴,则判定为阴性. ８　PCR方法 ８􀆰１　主要仪器和材料 ８􀆰１􀆰１　仪器 ８􀆰１􀆰１􀆰１　PCR基因扩增仪. ８􀆰１􀆰１􀆰２　高速台式冷冻离心机:最大转速大于１５０００r/min. ８􀆰１􀆰１􀆰３　低速大容量离心机:最大转速大于３０００r/min. ８􀆰１􀆰１􀆰４　微量可调移液器:２μL、１０μL、２０μL、２００μL、１０００μL. ８􀆰１􀆰１􀆰５　核酸电泳仪. ８􀆰１􀆰１􀆰６　核酸电泳槽. ８􀆰１􀆰１􀆰７　凝胶成像分析系统. ８􀆰１􀆰１􀆰８　组织研磨仪. ８􀆰１􀆰１􀆰９　高压蒸汽灭菌器. ８􀆰１􀆰１􀆰１０　水浴锅. ８􀆰１􀆰１􀆰１１　超净工作台. ８􀆰１􀆰１􀆰１２　紫外分光光度仪. ８􀆰１􀆰１􀆰１３　生物安全柜. ８􀆰１􀆰２　材料 ８􀆰１􀆰２􀆰１　外科手术剪. ８􀆰１􀆰２􀆰２　不锈钢镊子. ８􀆰１􀆰２􀆰３　一次性PE手套或乳胶手套. ８􀆰１􀆰２􀆰４　玻棒. ８􀆰２􀆰１􀆰５　烧杯:１００mL. ８􀆰２􀆰１􀆰６　陶瓷珠或不锈钢珠:直径２mm~１０mm. ８􀆰２􀆰１􀆰７　离心管:１􀆰５mL、２􀆰０mL、１５􀆰０mL、５０􀆰０mL. ８􀆰２􀆰１􀆰８　２００μLPCR管. ８􀆰２　试剂 ８􀆰２􀆰１　０􀆰０１mol/LpH７􀆰２磷酸盐缓冲液(PBS):按照B􀆰２描述的方法配制. ８􀆰２􀆰２　１×TAE电泳缓冲液:按照B􀆰３描述的方法配制. ８􀆰２􀆰３　１０mg/mL溴化乙锭(EB)或同类核酸染料:商品化试剂. ８􀆰２􀆰４　动物组织基因组DNA提取试剂盒:商品化试剂