2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 动 物 源 副 猪 嗜 血 杆 菌 分 离 与 鉴 定 技 术 规 程 2 2 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 7 . 1 2 0 . 1 0 C C S X 4 6 5 8 — 2 0 2 5 T e c h n i c a l c o d e o f p r a c t i c e f o r i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f H a e m o p h i l u s p a r a s u i s f r o m a n i m a l s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６５８—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口. 本文件起草单位:华中农业大学、中国兽医药品监察所、中国动物卫生流行病学中心、湖北省疾病预防 控制中心、吉林大学、山东省滨州畜牧兽医研究院. 本文件起草人:郝海红、张纯萍、徐士新、何启盖、王鹤佳、黄安雄、赵琪、余波、黄玲利、蔡旭旺、徐晓娟、 曲志娜、韩文瑜、顾敬敏、苗立中、王娟、张朋、阮紫涵、邹紫莹、张志浩、于学祥、孙琪、田野、杜鹏飞、陈玲、蒋 颖. ⅠNY/T４６５８—２０２５ 动物源副猪嗜血杆菌分离与鉴定技术规程 １　范围 本文件确立了副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)分离与鉴定的程序,规定了样品采集与保存运 输、分离纯化、筛查与鉴定、菌种保藏、生物安全要求的操作指示,描述了相应的试验方法. 本文件适用于动物源细菌耐药性监测对猪鼻腔拭子、肺脏、心包液、胸腔积液、腹腔积液、关节液和脑 脊液等样品中副猪嗜血杆菌的分离与鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB１９４８９　实验室生物安全通用要求 GB/T３４７５０　副猪嗜血杆菌检测方法 NY/T１９４８　兽医实验室生物安全要求通则 NY/T４１４１　动物源细菌耐药性监测样品采集技术规程 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　试剂或材料 ４􀆰１　要求 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T６６８２规定的三级水,培养基按附录A的规定 配制或用商品化产品. ４􀆰２　试剂 ４􀆰２􀆰１　胎牛血清. ４􀆰２􀆰２　烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD). ４􀆰２􀆰３　５０×TAE缓冲液. ４􀆰２􀆰４　琼脂糖. ４􀆰２􀆰５　PCR预混液(２×PCRMasterMix). ４􀆰２􀆰６　荧光定量PCR预混液(２×SYBRRealＧTimePCRMasterMix). ４􀆰２􀆰７　甘油. ４􀆰３　溶液制备 ４􀆰３􀆰１　NAD溶液:取NAD０􀆰１g,加水适量使溶解并稀释至１００mL,０􀆰２２μm无菌滤膜过滤. ４􀆰３􀆰２　１×TAE缓冲液:取５０×TAE缓冲液２０mL,加水至１０００mL. ４􀆰３􀆰３　１􀆰２％琼脂糖凝胶:取琼脂糖１􀆰２g,于１００mL１×TAE中加热,充分溶解. ４􀆰３􀆰４　基质溶液:取αＧ氰Ｇ４Ｇ羟基肉硅酸(HCCA),按说明书配制,或用市售商品. ４􀆰３􀆰５　灭菌甘油:取甘油适量,１２１℃高压灭菌２０min. １NY/T４６５８—２０２５ ４􀆰４　培养基制备 ４􀆰４􀆰１　CaryＧBlair氏运送培养基:按照附录A中A􀆰１的规定执行. ４􀆰４􀆰２　TSA培养基(含０􀆰１％NAD＋胎牛血清):按照A􀆰２的规定执行. ４􀆰４􀆰３　TSB培养基(含０􀆰１％NAD＋胎牛血清):按照A􀆰３的规定执行. ４􀆰４􀆰４　５％蔗糖脱脂乳保护剂:按照A􀆰４的规定执行. ４􀆰５　标准菌株 副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)[CVCC３８９４/CVCC３７２１/ATCC１９４１７]. ４􀆰６　材料 ４􀆰６􀆰１　生化鉴定试剂盒或鉴定. ４􀆰６􀆰２　细菌DNA提取试剂盒. ４􀆰６􀆰３　卡磁珠保藏管. ４􀆰６􀆰４　脱脂牛奶. ４􀆰６􀆰５　０􀆰２２μm无菌滤膜. ５　仪器设备 ５􀆰１　二级生物安全柜. ５􀆰２　冰箱:２℃~８℃,－２０℃或以下. ５􀆰３　分析天平:感量０􀆰０１g. ５􀆰４　移液器:０􀆰５μL~１０００μL. ５􀆰５　恒温培养箱. ５􀆰６　微生物生化鉴定系统. ５􀆰７　PCR仪. ５􀆰８　高速冷冻离心机:离心速度≥１２０００r/min. ５􀆰９　核酸电泳仪. ５􀆰１０　电泳凝胶成像分析系统. ５􀆰１１　荧光定量PCR仪. ５􀆰１２　微生物质谱仪(MALDIＧTOFMS). ５􀆰１３　显微镜:１０×~１００×. ６　分离鉴定程序 分离与鉴定程序见图１. ７　样品采集与保存运输 按照NY/T４１４１的规定执行. ８　分离纯化 无菌取鼻腔拭子、肺脏等样品涂布TSA培养基(含０􀆰１％NAD＋胎牛血清)１/４范围,用接种环划线, ３６℃(±１℃)培养２４h~４８h;用接种环蘸取心包液、胸腔积液、腹腔积液、关节液、脑脊液等样品划线接 种于TSA培养基(含０􀆰１％NAD＋胎牛血清),３６℃(±１℃)培养２４h~４８h. 挑取单个圆形、光滑湿润、颜色灰白、边缘整齐、透明或半透明的针尖大小可疑菌落,接种TSA培养基 (含０􀆰１％NAD＋胎牛血清),３６℃(±１℃)培养２４h~４８h,纯化,备用. ２NY/T４６５８—２０２５ 图１　副猪嗜血杆菌分离与鉴定程序 ９　筛查与鉴定 ９􀆰１　筛查 ９􀆰１􀆰１　形态学检查 取纯化菌落,按照GB/T３４７５０的规定执行. ９􀆰１􀆰２　卫星生长现象试验 取纯化菌落,按照GB/T３４７５０的规定执行. ９􀆰２　鉴定 ９􀆰２􀆰１　通则 生化鉴定、PCR鉴定、荧光定量PCR鉴定和质谱鉴定４种方法任选其一. ９􀆰２􀆰２　生化鉴定 按照GB/T３４７５０的规定执行,也可以使用生化鉴定试剂盒、鉴定卡或微生物生化鉴定系统鉴定. ９􀆰２􀆰３　PCR鉴定 ９􀆰２􀆰３􀆰１　模板制备 取新鲜的纯化菌落,加灭菌水０􀆰５mL,煮沸１０min,冰浴冷却,１２０００r/min离心２min.取上清液, 备用.或使用细菌DNA提取试剂盒提取DNA作为模板.副猪嗜血杆菌标准菌株作为阳性对照,水为阴 性对照. ９􀆰２􀆰３􀆰２　引物 引物序列及扩增片段长度见表１. ３NY/T４６５８—２０２５ 表１　副猪嗜血杆菌的PCR引物序列及扩增片段长度 细菌 引物序列 扩增片段长,bp 副猪嗜血杆菌上游引物(１６SRNAＧF):５′ＧGTGATGAGGAAGGGTGGTGTＧ３′ 下游引物(１６SRNAＧR):５′ＧGGCTTCGTCACCCTCTGTＧ３′８２１ ９􀆰２􀆰３􀆰３　反应体系 反应体系(２０μL)见表２. 表２　PCR反应体系 试剂 体积,μL ２×PCRMasterMix １０ 上游引物(１０μmol/L) １ 下游引物(１０μmol/L) １ 水(ddH２O) ７ 模板 １ ９􀆰２􀆰３􀆰４　反应条件 ９４℃预变性５min;９４℃变性１０s,５９℃退火１０s,７２℃延伸１min,３０个循环;７２℃延伸１０min. ９􀆰２􀆰３􀆰５　电泳 取PCR扩增产物,于１􀆰２％的琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像分析. ９􀆰２􀆰３􀆰６　结果判定 阳性菌扩增条带大小约８２１bp.阳性扩增产物需测序比对鉴定,相似度不低于９８％.副猪嗜血杆菌 标准菌的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果和正向引物测序结果见附录B中的B􀆰１和B􀆰２. ９􀆰２􀆰４　荧光定量PCR鉴定 ９􀆰２􀆰４􀆰１　模板制备 按９􀆰２􀆰３􀆰１的规定执行. ９􀆰２􀆰４􀆰２　引物 荧光定量PCR引物序列见表３. 表３　副猪嗜血杆菌的荧光定量PCR引物序列 细菌 引物序列 副猪嗜血杆菌上游引物(１６SRNAＧF):５′ＧAGTAGCAGCTGACGATGGCGTAATＧ３′ 下游引物(１６SRNAＧR):５′ＧTCTACACGCTCTGGGTTTGCTTCTＧ３′ ９􀆰２􀆰４􀆰３　反应体系 荧光定量PCR反应体系(２５μL)见表４.避光条件下配置. 表４　PCR反应体系 试剂 体积,μL ２×SYBRRealＧTimePCRMasterMix １２􀆰５ 上游引物(１０μmol/L) ０􀆰５ 下游引物(１０μmol/L) ０􀆰５ 水(ddH２O) １０􀆰５ 模板 １􀆰０ ９􀆰２􀆰４􀆰４　反应条件 ９５℃预变性３min;９５℃变性１５s,５８℃退火２０s,７２℃延伸１５s,４０个循环,每个循环结束时收集 荧光. ９􀆰２􀆰４􀆰５　质控要求 ４NY/T４６５８—２０２５ 质控应符合: a)　阳性对照Ct值≤２９􀆰０,且有特定扩增曲线; b)　阴性对照Ct值＞３２􀆰０或无,且无特定扩增曲线. 荧光定量PCR扩增曲线见附录C. ９􀆰２􀆰４􀆰６　结果判定 ９􀆰２􀆰４􀆰６􀆰１　阳性 Ct值≤２９􀆰０,有特定扩增曲线. ９􀆰２􀆰４􀆰６􀆰２　阴性 Ct值＞３２􀆰０或无,无特定扩增曲线. ９􀆰２􀆰４􀆰６􀆰３　可疑 ２９􀆰０＜Ct值≤３