2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 猫 泛 白 细 胞 减 少 症 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 4 6 6 1 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r f e l i n e p a n l e u k o p e n i a Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６６１—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国伴侣动物(宠物)标准化技术委员会(SAC/TC５４１)归口. 本文件起草单位:军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所、宁夏大学、北京市动物疫病预防控制 中心、广东省农业科学院动物卫生研究所、天津瑞普生物技术股份有限公司. 本文件主要起草人:扈荣良、陈腾、赵洪进、李敏、张菲、齐宇、张艳艳、周鑫韬、张守峰、郝秀静、王林、张 启龙、王晓虎、罗胜军、车艳杰、黄旺森. ⅠNY/T４６６１—２０２５ 猫泛白细胞减少症诊断技术 １　范围 本文件规定了猫泛白细胞减少症临床诊断、样品采集、保存、运输、实验室诊断及综合判定的要求. 本文件适用于猫泛白细胞减少症的诊断. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. NY/T５４１　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. FPV:猫泛白细胞减少症病毒(felinepanleukopeniavirus) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RealＧtimePCR:实时聚合酶链式反应(realＧtimepolymerasechainreaction) RealＧtimeRPA:实时重组酶聚合酶扩增(realＧtimerecombinasepolymeraseamplification) LAMP:环介导等温扩增(loopＧmediatedisothermalamplification) ５　临床诊断 ５􀆰１　临床症状 ５􀆰１􀆰１　FPV感染具有高度接触传染性,潜伏期一般２d~７d,可引起全身感染.临床表现多样,分为特 急性型、急性型、亚急性型和亚临床感染: a)　特急性型不待临床症状出现即突然死亡; b)　急性型多见于幼龄猫,早期多见呕吐、腹泻症状,病情发展迅速,可于２４h内死亡; c)　亚急性型病程可持续数日,呈双相热,第一次发热体温在４０℃左右,持续１d,平息数天后第二次 发热,体温４０℃以上,同时出现精神沉郁、厌食、呕吐、血便以及脱水等症状; d)　亚临床感染多见于老龄猫和免疫猫,无明显临床症状. ５􀆰１􀆰２　孕猫感染时,可导致怀孕母猫流产、胎儿早期死亡、新生猫死亡或表现出共济失调综合征等中枢神 经系统症状. ５􀆰２　血常规检查 采血进行化验,检查白细胞数、红细胞数、血小板数、血红蛋白、红细胞比容.疾病最初阶段,白细胞明 显减少,通常小于４􀆰０×１０９个/L(正常值为５􀆰５×１０９个/L~１９􀆰５×１０９个/L).总白细胞数小于２􀆰０×１０９ 个/L时常预后不良.白细胞减少症发生后,嗜中性粒细胞数可能在２４h~４８h内回升,并伴有明显核左 移.肠道感染猫可能因便血导致贫血和血小板减少. ６　样品采集、保存和运输 ６􀆰１　采集 １NY/T４６６１—２０２５ 取疑似病猫肛拭子或病死猫肠内容物,放入盛有０􀆰５mL灭菌PBS样品管中.PBS配制方法符合附 录A中A􀆰１的要求.标记编号,同时填写送检单. ６􀆰２　保存 样品管在２℃~８℃条件下保存,应不超过４８h,不高于－２０℃可长期保存. ６􀆰３　运输　 样品管应置于干冰或冰块的冷藏包装中,保持全程冷链运输.样品运输应符合NY/T５４１的相关要 求. ７　实验室诊断 ７􀆰１　病毒分离和鉴定　 ７􀆰１􀆰１　仪器、设备和耗材 二氧化碳恒温培养箱、微量组织研磨器、台式离心机、细胞培养瓶、０􀆰２２μm针式微量滤器、离心管等. ７􀆰１􀆰２　试剂 DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶ＧEDTA、含１００００IU/mL青霉素和１００００μg/mL链霉素的溶液. ７􀆰１􀆰３　细胞　 F８１细胞. ７􀆰１􀆰４　FPV特异性阳性血清 应用猫制备FPV特异性阳性血清.制备方法符合附录B的要求. ７􀆰１􀆰５　样品处理　 取２００μL样品液,加入８００μl的PBS中混匀,２℃~８℃１００００r/m离心５min,取上清,转移至新 的１􀆰５mL灭菌离心管,加等体积含１００IU/mL青霉素和１００μg/mL链霉素的DMEM培养基,混匀后以 ０􀆰２２μm针式微量滤器过滤除菌,收集滤过液备用. ７􀆰１􀆰６　病毒分离 取７􀆰１􀆰５中过滤液,用氯仿处理样品,高速离心后,取中间水相,备用.取传代后６h的F８１细胞,弃 上清,按照细胞培养液体积的５％接种氯仿处理后的样品,在３７℃恒温箱内吸附１h,弃样品,加入含有 ２％胎牛血清DMEM培养基,或在F８１细胞传代的同时接种样品,置３７℃、５％CO２培养箱培养.同时设 未接种样品的F８１细胞对照２孔.每天观察１次,至少观察３d,记录细胞生长状态.细胞长满后传代,盲 传代次不应超过３次.如盲传三代内出现细胞病变,则进一步对细胞培养物进行鉴定. ７􀆰１􀆰７　病毒鉴定 取产生细胞病变的细胞培养物０􀆰５mL~１􀆰０mL,加入等体积的FPV阳性血清,３７℃作用１h,在F８１ 细胞传代同时接种,置３７℃、５％CO２培养箱培养.同时设不接种的F８１细胞对照和产生病变细胞培养物 接种孔各２孔.连续观察３d~７d.记录细胞生长状态. ７􀆰１􀆰８　判定 ７􀆰１􀆰８􀆰１　在７􀆰１􀆰６中,样品接种细胞盲传三代任何一代细胞出现细胞病变如细胞拉丝、破碎、脱落等,不 接种的对照细胞无病变,则判定FPV疑似. ７􀆰１􀆰８􀆰２　在７􀆰１􀆰７中,不接种的F８１细胞对照孔均无细胞病变,病变细胞培养物接种孔出现细胞病变, 而细胞培养物原液及各梯度稀释液加血清中和孔无病变,则可判定待检样品含有FPV. ７􀆰２　金标试纸条检测 ７􀆰２􀆰１　操作 取７􀆰１􀆰５中的待检样品液,按照试纸条使用说明进行操作. ７􀆰２􀆰２　判定 按照试纸条使用说明进行结果判定. ７􀆰３　常规PCR诊断 ２NY/T４６６１—２０２５ ７􀆰３􀆰１　仪器、设备和耗材 小型台式离心机、生物安全柜、冰柜、可调量程的移液器、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像仪、PCR反应 管、灭菌吸头等. ７􀆰３􀆰２　试剂 DNA提取试剂或试剂盒、２×PCR预混酶、去离子水、电泳及制胶缓冲液.其中,电泳及制胶缓冲液 即为１×TAE,配制方法按照附录A􀆰２的规定执行. ７􀆰３􀆰３　引物合成与稀释 针对FPVVP２基因进行引物设计、合成、制备. 上游引物F１序列为５′ＧGGAACTAGTGGCACACCAACAＧ３′; 下游引物R１序列为５′ＧGGCCCTTGTGTAGACGCTTＧ３′. 预期扩增核酸片段大小是３８６bp.由基因合成公司进行合成并提供鉴定报告.各引物分别以灭菌 双蒸水或去离子水进行溶解,浓度为１０μmol/L. ７􀆰３􀆰４　样品DNA提取 使用DNA提取试剂盒对６􀆰１中采集的样品和阳性样品对照、阴性样品对照进行DNA提取,按试剂 盒说明书操作.其中,阳性样品对照和阴性样品对照的制备方式分别按照C􀆰１和C􀆰２的规定执行. ７􀆰３􀆰５　扩增 ７􀆰３􀆰５􀆰１　使用２×PCR预混酶,按照说明书配制反应体系,２０μL体系配制见表１.设被检样品、阴性对 照样品和阳性对照样品的份数总和为N. 表１　常规PCR体系配制 成分 加入量,μL 引物F１ N＋１ 引物R１ N＋１ ２×PCR预混酶 １０×(N＋１) 去离子水 ７×(N＋１) ７􀆰３􀆰５􀆰２　PCR反应管中,做好标记,每管加入１９μL７􀆰３􀆰５􀆰１中配制的预混液,取７􀆰３􀆰４提取的样品 DNA１μL加入对应管,与预混液充分混匀,盖上管盖.瞬时离心,将液体集中至管底. ７􀆰３􀆰５􀆰３　按说明书进行扩增条件设置,扩增循环数为３０. ７􀆰３􀆰６　电泳 取扩增产物５μL~１０μL点样于１􀆰０％琼脂糖凝胶孔中,以１００V~１２０V电压于１×TAE缓冲液中 电泳约２０min,凝胶成像仪中观察结果. ７􀆰３􀆰７　判定 阳性对照样品出现３８６bp扩增带,阴性对照样品在相应位置无扩增带出现时,检测结果成立. 被检样品出现３８６bp扩增带时判为FPV核酸阳性,否则判为阴性. ７􀆰３􀆰８　阳性扩增产物的核苷酸序列测定 根据诊断需要可选做.收集纯化PCR产物,送测序公司,以上、下游引物进行PCR产物的序列测定, 有助于进一步确认FPV基因序列和毒株来源.其中,测序结果的碱基比对参考序列见附录D. ７􀆰４　RealＧtimePCR诊断 ７􀆰４􀆰１　仪器、设备和耗材 小型台式离心机、生物安全柜、冰柜、可调量程的移液器、荧光定量PCR仪、定量PCR反应管、灭菌带 滤芯吸头等. ７􀆰４􀆰