2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 饲 料 中 安 普 霉 素 的 测 定 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 6 7 8 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f a p r a m y c i n i n f e e d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 农 业 部 1 4 8 6 号 公 告 — 3 — 2 0 1 0NY/T４６７８—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件代替农业部１４８６号公告—３—２０１０«饲料中安普霉素的测定　高效液相色谱法»,与农业部 １４８６号公告—３—２０１０相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　更改了适用范围、检出限和定量限(见第１章,农业部１４８６号公告—３—２０１０的第１章); b)　增加了仲裁法“液相色谱串联质谱法”(见第４章); c)　更改了试样提取方法(见５􀆰５􀆰１,农业部１４８６号公告—３—２０１０的７􀆰１). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由中华人民共和国农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:西南民族大学、四川特驱农牧科技集团有限公司、四川众检四方检验检测技术有限 公司. 本文件主要起草人:柏雪、何利梅、梅绍锋、虞洁、付晓、黄李蓉、史海涛、陈柳、胡易容、林涛. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１０年首次发布为农业部１４８６号公告—３—２０１０; ———本次为第一次修订. ⅠNY/T４５６１—２０２５ 饲料中安普霉素的测定 １　范围 本文件描述了饲料中安普霉素的液相色谱串联质谱和高效液相色谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和复合预混合饲料中安普霉素的测定. 本文件中液相色谱串联质谱法的检出限为０􀆰０４mg/kg、定量限为０􀆰１０mg/kg,高效液相色谱法的 检出限为２mg/kg、定量限为５mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　液相色谱串联质谱法(仲裁法) ４􀆰１　原理 试样中的安普霉素用盐酸溶液提取,经混合型强阳离子固相萃取柱净化后,用液相色谱串联质谱仪 测定,内标法定量. ４􀆰２　试剂或材料 注意:标准溶液配制和贮存、样品溶液不应使用玻璃材质容器. 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ４􀆰２􀆰１　水:GB/T６６８２规定的一级水. ４􀆰２􀆰２　甲醇:色谱级. ４􀆰２􀆰３　乙腈:色谱级. ４􀆰２􀆰４　甲酸:色谱级. ４􀆰２􀆰５　异丙醇:色谱级. ４􀆰２􀆰６　盐酸溶液(０􀆰１mol/L):移取８􀆰４mL浓盐酸,用水稀释定容至１０００mL,混匀. ４􀆰２􀆰７　５％氨水甲醇溶液:量取２０mL甲醇(４􀆰２􀆰２)于１００mL容量瓶中,加入５mL氨水,然后用甲醇 (４􀆰２􀆰２)定容,混匀. ４􀆰２􀆰８　乙酸铵溶液(０􀆰０１mol/L):称取０􀆰７７g乙酸铵,用水溶解并稀释至１０００mL,混匀. ４􀆰２􀆰９　乙酸铵溶液(０􀆰００２mol/L):取１００mL乙酸铵溶液(４􀆰２􀆰８),加水稀释至５００mL,混匀. ４􀆰２􀆰１０　复溶液:取２０mL甲酸(４􀆰２􀆰４)、１０mL异丙醇(４􀆰２􀆰５)和１７０mL乙酸铵溶液(４􀆰２􀆰９),混匀,用 甲酸(４􀆰２􀆰４)调节pH至０􀆰８. ４􀆰２􀆰１１　标准储备溶液(１mg/mL):准确称取２９􀆰５mg硫酸安普霉素标准品(CAS:６５７１０Ｇ０７Ｇ８,纯度不低 于９６％)于２５mL聚丙烯容量瓶中,加水溶解,并定容,混匀.于２℃~８℃保存,有效期为１个月. ４􀆰２􀆰１２　标准中间溶液(１００μg/mL):准确移取１０mL标准储备溶液(４􀆰２􀆰１１)于１００mL聚丙烯容量瓶 １NY/T４５６１—２０２５ 中,用水稀释定容,混匀.于２℃~８℃保存,有效期为５天. ４􀆰２􀆰１３　标准工作溶液(１０μg/mL):准确移取１０mL标准中间溶液(４􀆰２􀆰１２),置于１００mL聚丙烯容量 瓶中,用复溶液(４􀆰２􀆰１０)稀释定容,混匀.临用现配. ４􀆰２􀆰１４　内标储备溶液(０􀆰０２mg/mL):准确称取１􀆰１１mg醋酸安普霉素ＧD７标准品(纯度不低于９６％)于 ５０mL聚丙烯容量瓶中,加水溶解,并定容,混匀.于２℃~８℃保存,有效期为１个月. ４􀆰２􀆰１５　内标工作溶液(１０μg/mL):准确移取５mL内标储备溶液(４􀆰２􀆰１４)于１０mL聚丙烯容量瓶中, 用水稀释定容,混匀.于２℃~８℃保存,有效期为２周. ４􀆰２􀆰１６　混合标准系列溶液:准确移取适量标准工作溶液(４􀆰２􀆰１３)和内标工作溶液(４􀆰２􀆰１５)于１０mL聚 丙烯容量瓶中,用复溶液(４􀆰２􀆰１０)稀释定容配成混合标准系列溶液,质量浓度分别为２０ng/mL、 ５０ng/mL、１００ng/mL、２５０ng/mL、５００ng/mL、１０００ng/mL.内标浓度为２５０ng/mL.临用现配. ４􀆰２􀆰１７　流动相A:移取５mL甲酸(４􀆰２􀆰４),１０mL乙酸铵溶液(４􀆰２􀆰８),加乙腈(４􀆰２􀆰３)定容至５００mL, 混匀. ４􀆰２􀆰１８　流动相B:移取５mL甲酸(４􀆰２􀆰４),１０mL乙酸铵溶液(４􀆰２􀆰８),加水定容至５００mL,混匀. ４􀆰２􀆰１９　混合型强阳离子固相萃取柱:６０mg/３mL,或性能相当者. ４􀆰２􀆰２０　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ４􀆰３　仪器设备 ４􀆰３􀆰１　液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾离子源. ４􀆰３􀆰２　分析天平:精度为０􀆰１mg. ４􀆰３􀆰３　离心机:转速不低于７０００r/min. ４􀆰３􀆰４　涡旋混合器. ４􀆰３􀆰５　超声波清洗器. ４􀆰３􀆰６　固相萃取装置. ４􀆰３􀆰７　pH计:精度为０􀆰０１. ４􀆰４　　样品 按GB/T２０１９５制备样品,至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的分析筛,充分混匀,装入 密闭容器中保存,备用. ４􀆰５　试验步骤 ４􀆰５􀆰１　提取 平行做２份试验.称取试样约２g(精确至０􀆰１mg),置于５０mL聚丙烯离心管中,加入０􀆰１mL内标 工作溶液(４􀆰２􀆰１５),准确加入２０mL盐酸溶液(４􀆰２􀆰６),涡旋混合１min,超声提取３０min,７０００r/min离 心１０min,上清液备用. ４􀆰５􀆰２　净化 依次用５mL甲醇(４􀆰２􀆰２)、５mL盐酸溶液(４􀆰２􀆰６)活化固相萃取柱(４􀆰２􀆰１９),准确移取５mL上清液 (４􀆰５􀆰１)过柱,控制流速不超过１mL/min.分别用５mL盐酸溶液(４􀆰２􀆰６)、５mL甲醇(４􀆰２􀆰２)淋洗,抽 干,用５mL５％氨水甲醇溶液(４􀆰２􀆰７)洗脱,收集洗脱液于聚丙烯离心管中,在６０℃氮气吹干.准确加入 １mL复溶液(４􀆰２􀆰１０)溶解,涡旋混匀,过微孔滤膜(４􀆰２􀆰２０)于聚丙烯瓶中,待测. ４􀆰５􀆰３　测定 ４􀆰５􀆰３􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:酰胺柱,柱长１００mm,内径２􀆰１mm,粒径１􀆰７μm;或性能相当者. b)　柱温:３５℃. c)　流速:０􀆰３mL/min. d)　进样量:１０μL. ２NY/T４５６１—２０２５ e)　流动相:梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序(液相色谱串联质谱法) 时间,min 流动相A,％ 流动相B,％ ０􀆰０ ８０ ２０ ２􀆰５ ８０ ２０ ３􀆰５ ３５ ６５ ５􀆰５ １０ ９０ ６􀆰７ １０ ９０ ７􀆰５ ８０ ２０ １２􀆰０ ８０ ２０ ４􀆰５􀆰３􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI＋). b)　检测方式:多反应监测(MRM). c)　毛细管电压:３􀆰５kV. d)　干燥气温度:３００℃. 多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量见表２. 表２　多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值 被测物名称监测离子对 m/z锥孔电压 V碰撞能量 eV 安普霉素５４０􀆰１＞２１６􀆰９ ９２ ２８ ５４０􀆰１＞３７８􀆰０a９２ １６ 安普霉素ＧD７５４７􀆰３＞２１７􀆰０ １５４ ２８ ５４７􀆰３＞３８１􀆰１a１５４ １６ 　　a为定量离子对. ４􀆰５􀆰３􀆰３　混合标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取混合标准系列溶液(４􀆰２􀆰１６)和试样溶液(４􀆰５􀆰２)上机测定.安普霉素混 合标准溶液的定量离子对色谱图见附录A. ４􀆰５􀆰３􀆰４　定性 在相同试验条件下,试样溶液与混合标准系列溶液中安普霉素的保留时间相对偏差应在±２􀆰５％之 内.根据表２选择的定性离子对,比较试样谱图中安普霉素定性离子的相对离子丰度与质量浓度接近的 混合标准系列溶液中对应的定性离子的相对离子丰度,若偏差不超过表３规定的范围,则可判定为样品中 存在安普霉素. 表３　定性测定时相对离子丰度的最大