2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 饲 料 中 硫 酸 黏 菌 素 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 6 7 9 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f c o l i s t i n s u l f a t e i n f e e d s — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 农 业 部 2 0 8 6 号 公 告 — 6 — 2 0 1 4NY/T４６７９—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 本文件代替农业部２０８６号公告—６—２０１４«饲料中硫酸黏杆菌素的测定　液相色谱串联质谱法». 与农业部２０８６号公告—６—２０１４相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　更改了“范围”(见第１章,２０１４年版的第１章); b)　更改了硫酸黏菌素标准品(见５􀆰１０,２０１４版的５􀆰１０); b)　更改了提取溶剂(见８􀆰１,２０１４年版的７􀆰１); c)　增加了正己烷处理等步骤(见８􀆰１); d)　更改了液相色谱流动相与梯度洗脱程序(见８􀆰３􀆰１,２０１４版的７􀆰３􀆰１); e)　更改了标准曲线范围(见８􀆰３,２０１４版的７􀆰２); f)　更改了试验数据处理(见第９章,２０１４版的第８章). g)　更改了精密度要求(见第１０章,农业部２０８６号公告—６—２０１４版的第９章). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由中华人民共和国农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:中国农业大学、辽宁省检验检测认证中心、农业农村部农产品质量安全监督检验测 试中心(大连). 本文件主要起草人:程林丽、沈建忠、陈亚南、秦千禧、于家丰、葛祥武. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１４年首次发布的为农业部２０８６号公告—６—２０１４; ———本次为第一次修订. ⅠNY/T４６７９—２０２５ 饲料中硫酸黏菌素的测定　液相色谱串联质谱法 １　范围 本文件描述了饲料中硫酸黏菌素的液相色谱串联质谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料中硫酸黏菌素的测定. 本文件硫酸黏菌素检出限为０􀆰０２mg/kg;硫酸黏菌素定量限为０􀆰１mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中的硫酸黏菌素用５％草酸溶液提取,经正己烷和固相萃取柱净化后,用液相色谱串联质谱仪 检测,基质匹配标准溶液校准,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰２　甲醇:色谱级. ５􀆰３　乙腈:色谱级. ５􀆰４　甲酸:色谱级. ５􀆰５　５％草酸溶液:称取５g草酸,用水溶解,定容至１００mL. ５􀆰６　甲酸溶液:移取１mL甲酸,加水至１０００mL,混匀. ５􀆰７　０􀆰２％甲酸溶液:准确移取２mL甲酸至１０００mL容量瓶中,加水定容,混匀. ５􀆰８　０􀆰２％甲酸甲醇溶液:准确移取２mL甲酸至１０００mL容量瓶中,加甲醇定容,混匀. ５􀆰９　乙腈Ｇ０􀆰２％甲酸溶液:乙腈(５􀆰３)＋０􀆰２％甲酸溶液(５􀆰７)＝２００＋８００(v/v). ５􀆰１０　标准储备溶液(１mg/mL):分别称取９􀆰２４mg(精确到０􀆰０１mg)的黏菌素A(CAS号:７７２２Ｇ４４Ｇ３, 纯度不低于９８％,折换算成硫酸黏菌素A的质量为１０mg),和１０mg(精确到０􀆰０１mg)的硫酸黏菌素B (CAS号:１３３８０５５Ｇ８８Ｇ１,纯度不低于９８％),用甲酸溶液(５􀆰６)溶解,转移至同一１０mL容量瓶中,用甲酸 溶液(５􀆰６)稀释并定容,混匀.－１８℃以下保存,有效期６个月. 注:定值或有证标准物质也适用. ５􀆰１１　标准中间溶液Ⅰ(１００μg/mL):准确移取１mL标准储备溶液(５􀆰１０),用甲酸溶液(５􀆰６)稀释定容 至１０mL,混匀.－１８℃以下保存,有效期６个月. ５􀆰１２　标准中间溶液Ⅱ(１０μg/mL):准确移取１mL标准中间溶液I(５􀆰１１),用甲酸溶液(５􀆰６)稀释定容 至１０mL,混匀.－１８℃以下保存,有效期６个月. １NY/T４６７９—２０２５ ５􀆰１３　亲水亲脂平衡(HLB)固相萃取小柱:５００mg/６mL. ５􀆰１４　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾离子源. ６􀆰２　分析天平:精度０􀆰００１g和０􀆰０１mg. ６􀆰３　旋涡混合器. ６􀆰４　离心机:转速不低于８０００r/min. ６􀆰５　固相萃取装置. ６􀆰６　氮吹仪. ７　样品 按照GB/T２０１９５制备样品,取样品至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的分析筛,充分混 匀,装入密闭容器中,备用.选取与待测样品类型相同,均匀一致,且在待测物保留时间处仪器响应值小于 方法定量限３０％的饲料样品,作为基质空白样品. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做２份试验.称取试样２g(精确至０􀆰００１g)置于２０mL离心管中,准确加入５％草酸溶液(５􀆰５) ２０mL,涡旋混合１min,超声提取１５min(每隔５min取出涡旋混合１０s),于８０００r/min离心５min,转 移上清液至另一管中,加入１０mL正己烷,涡旋混合３０s,８０００r/min离心５min,除去上层正己烷,下层 溶液备用. ８􀆰２　净化 依次用５mL甲醇(５􀆰２)和５mL甲酸溶液(５􀆰６)预淋洗HLB小柱(５􀆰１３).将备用溶液(８􀆰１)全部通 过小柱,依次用甲酸溶液(５􀆰６)５mL、水５mL淋洗,用甲醇５mL(５􀆰２)洗脱,收集洗脱液于玻璃试管中,于 ４０℃下用氮气吹至近干,准确加入１mL乙腈Ｇ０􀆰２％甲酸溶液(５􀆰９)溶解,涡旋混匀,微孔滤膜(５􀆰１４)过 滤,待测. ８􀆰３　基质匹配标准系列溶液的制备 取空白试样,按８􀆰１和８􀆰２处理得到空白基质溶液.分别准确移取标准中间溶液II(５􀆰１２)适量,于４０ ℃下氮气吹至近干,用空白基质溶液稀释,配制成质量浓度分别为２０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、 ５００ng/mL、１０００ng/mL、５０００ng/mL基质匹配标准系列溶液. ８􀆰４　测定 ８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长５０mm,内径２􀆰１mm,粒度１􀆰７μm,或性能相当者; b)　柱温:４０℃; c)　流速:０􀆰３mL/min; d)　进样体积:１０(L; e)　流动相:A相,０􀆰２％甲酸溶液(５􀆰７);B相,０􀆰２％甲酸甲醇溶液(５􀆰８),梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序 时间 minA ％B ％ ０􀆰０ ９５ ５ ２NY/T４６７９—２０２５ 表１(续) 时间 minA ％B ％ ２􀆰０ ９５ ５ ３􀆰０ １０ ９０ ４􀆰０ １０ ９０ ５􀆰０ ９５ ５ ８􀆰４􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾离子源,正离子模式(ESI＋); b)　检测方式:多反应监测(MRM); c)　毛细管电压:１􀆰５kV; d)　离子源温度:１２０℃; e)　去溶剂温度:３４０℃; f)　脱溶剂气:氮气６００L/h; g)　二级碰撞气:氩气２９L/h; 多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值见表２. 表２　多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值 待测物监测离子对 m/z锥孔电压 V碰撞能 eV 黏菌素A３９０􀆰７＞３７９􀆰０ ３９０􀆰７＞３８４􀆰８a２５１２ １３ 黏菌素B３８６􀆰２＞３７４􀆰３ ３８６􀆰２＞３８０􀆰２a２５１２ １２ 　　a为定量离子 ８􀆰４􀆰３　基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配标准系列溶液(８􀆰３)和试样溶液(８􀆰２)上机测定.基质匹配标 准溶液的定量离子色谱图见附录A. ８􀆰４􀆰４　定性 在相同试验条件下,试样溶液(８􀆰２)与基质匹配标准系列溶液(质量浓度相当)中待测物的保留时间相 对偏差应在±２􀆰５％之内.根据表２选择的定性离子对,比较试样谱图中待测物定性离子的相对离子丰度 与浓度接近的基质匹配标准系列溶液中对应的定性离子的相对离子丰度,若偏差不超过表３规定的范围, 则可判定为样品中存在对应的待测物. 表３　定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度,％ ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 最大允许偏差,％ ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ８􀆰４􀆰５　定量 以基质匹配标准溶液