2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 饲 料 中 6 种 大 环 内 酯 类 驱 虫 药 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 6 8 0 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f s i x k i n d s o f M a c r o l i d e - l i k e a n t h e l m i n t i c s i n f e e d s — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 农 业 部 1 4 8 6 号 公 告 — 5 — 2 0 1 0NY/T４６８０—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 本文件代替农业部１４８６号公告—５—２０１０«饲料中阿维菌素类药物的测定　液相色谱串联质谱法». 与农业部１４８６号公告—５—２０１０相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: ———增加了药物种类,更改了适用范围(见第１章); ———更改了提取液与净化方法(见８􀆰２,２０１０年版７􀆰２); ———更改了精密度要求(见第１０章,２０１０年版的第９章) ———更改了液相色谱参考条件(见８􀆰４􀆰１,２０１０年版的７􀆰３􀆰１); ———更改了串联质谱参考条件(见８􀆰４􀆰２,２０１０年版的７􀆰３􀆰２). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:中国农业大学. 本文件主要起草人:程林丽、沈建忠、陈亚南、秦千禧、赵军杰、雷艳敏、王鑫. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２０１０年首次发布为农业部１４８６号公告—５—２０１０. ———本次为第一次修订. ⅠNY/T４６８０—２０２５ 饲料中６种大环内酯类驱虫药的测定　液相色谱串联质谱法 １　范围 本文件描述了饲料中阿维菌素、乙酰氨基阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、莫西克丁和米尔贝肟的液相 色谱串联质谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中阿维菌素、乙酰氨基阿维菌素、 伊维菌素、多拉菌素、莫西克丁和米尔贝肟的测定. 本文件阿维菌素、乙酰氨基阿维菌素、伊维菌素和多拉菌素的检出限为１０μg/kg,莫西克丁和米尔贝 肟的检出限为２５μg/kg;阿维菌素、乙酰氨基阿维菌素、伊维菌素和多拉菌素的定量限为２５μg/kg,莫西 克丁和米尔贝肟的定量限为５０μg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中的待测物用乙腈提取,经正己烷和固相萃取柱净化,用液相色谱串联质谱仪检测,基质匹配标 准溶液校准,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰２　乙腈:色谱级. ５􀆰３　甲醇:色谱级. ５􀆰４　甲酸:色谱级. ５􀆰５　乙腈饱和的正已烷:色谱级. ５􀆰６　淋洗液Ⅰ:取１８０mL乙腈(５􀆰２),加入８２０mL水,混匀. ５􀆰７　淋洗液Ⅱ:取１８０mL甲醇(５􀆰３),加入８２０mL水,混匀. ５􀆰８　９０％甲醇溶液(体积分数):取９００mL甲醇(５􀆰３)和１００mL水,混匀. ５􀆰９　０􀆰３％甲酸溶液(体积分数):取３mL甲酸(５􀆰４),用水稀释定容至１􀆰０L,混匀. ５􀆰１０　标准储备溶液(１mg/mL):称取阿维菌素B１a(纯度不低于９８％)、乙酰氨基阿维菌素B１a(纯度不 低于９８％)、伊维菌素H２B１a(纯度不低于９８％)、多拉菌素(纯度不低于９５％)、莫西克丁(纯度不低于 ９８％)、米尔贝肟(纯度不低于９８％)各１０mg(精确到０􀆰０１mg),分别用乙腈溶解,定容至１０mL,混匀. 各药物信息见附录A.标准储备溶液于－１８℃以下保存,有效期３个月. １NY/T４６８０—２０２５ ５􀆰１１　混合标准溶液(１００μg/mL):准确移取标准储备溶液(５􀆰１０)各１mL置于１０mL容量瓶中,用乙腈 稀释并定容.于２℃~８℃保存,有效期１个月. ５􀆰１２　混合标准系列溶液:分别准确移取适量混合标准溶液(５􀆰１１)于１００mL容量瓶中,用甲醇溶液 (５􀆰８)稀释定容,配制成质量浓度分别为５ng/mL、１０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、５００ng/mL、 １０００ng/mL的混合标准系列溶液.于２℃~８℃保存,有效期１周. ５􀆰１３　亲水亲脂平衡(HLB)固相萃取小柱:５００mg/６mL. ５􀆰１４　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾电离源. ６􀆰２　分析天平:精度０􀆰００１g和０􀆰０１mg. ６􀆰３　涡旋混合器. ６􀆰４　振荡器. ６􀆰５　离心机:转速不低于８０００r/min. ６􀆰６　固相萃取装置. ６􀆰７　氮吹仪. ７　样品 按照GB/T２０１９５制备样品,取样品至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm孔径的分析筛,充分混 匀,装入密闭容器中,备用.选取与待测样品类型相同,均匀一致,且在待测物保留时间处仪器响应值小于 方法定量限３０％的饲料样品,作为基质空白样品. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取 平行做２份试验.称取试样２g(精确到０􀆰００１g)于５０mL离心管中,准确加入１０mL乙腈(５􀆰２),涡 旋１min,４０℃条件下３００r/min振荡４０min,４℃条件下８０００r/min离心１０min,取上清液于另一离心 管中.下层残渣准确加入１０mL乙腈(５􀆰２)重复操作一次.合并上清液. ８􀆰２　净化 ８􀆰２􀆰１　正己烷净化 ８􀆰２􀆰１􀆰１　配合饲料与浓缩饲料 取２􀆰５mL上清液(８􀆰１),加入１mL水和１􀆰５mL用乙腈饱和的正己烷(５􀆰５),涡旋３０s,８０００r/min 离心１０min,除去上层正已烷.下层再加１􀆰５mL乙腈饱和的正己烷(５􀆰５)重复操作一次.下层溶液于 ６５℃氮气吹至２mL左右,依次加入８mL水和１０mL乙腈饱和的正己烷(５􀆰５),涡旋混合１min.４℃条 件下,８０００r/min离心１０min,弃去下层水相.上层正己烷溶液于６５℃氮吹干.加入１mL乙腈(５􀆰２) 复溶,加入５mL水,涡旋均匀,待过柱净化. ８􀆰２􀆰１􀆰２　其它饲料 取２􀆰５mL上清液(８􀆰１),加入１􀆰５mL乙腈饱和的正己烷,涡旋３０s,８０００r/min离心１０min,除去 正己烷.下层再加入１􀆰５mL乙腈饱和的正己烷,重复操作１次.下层乙腈溶液６５℃氮气吹至１mL左 右,加入５mL水(５􀆰１),涡旋混匀,待过柱净化. ８􀆰２􀆰２固相萃取净化 依次用５mL乙腈(５􀆰２)、５mL淋洗液I(５􀆰６)活化HLB小柱(５􀆰１３).将试样溶液(８􀆰２􀆰１)全部过 HLB柱.依次用淋洗液Ⅰ(５􀆰６)５mL和淋洗液Ⅱ(５􀆰７)５mL淋洗,抽干;再用６mL甲醇(５􀆰３)以小于 １mL/min的流速洗脱;６５℃氮气吹干,准确加入１mL的９０％甲醇溶液(５􀆰８),涡旋混匀,微孔滤膜(５􀆰１４) ２NY/T４６８０—２０２５ 过滤,作为试样溶液,待测. ８􀆰３　基质匹配标准系列溶液的制备 称取空白试样,按８􀆰１~８􀆰２步骤处理至６５℃氮气吹干,准确移取混合标准系列溶液(５􀆰１２)各１mL, 涡旋混匀,配制成质量浓度分别为５ng/mL、１０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、５００ng/mL、１０００ng/mL 的基质匹配标准系列溶液,微孔滤膜(５􀆰１４)过滤,备用. ８􀆰４　测定 ８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长５０mm,内径２􀆰１mm,粒径１􀆰７μm,或性能相当者; b)　柱温:４０℃; c)　流速:０􀆰２mL/min; d)　进样体积:５μL; e)　流动相:A相,０􀆰３％甲酸溶液(５􀆰９);B相,甲醇(５􀆰３),洗脱程序见表１; 表１　梯度洗脱程序 时间,min A相,％ B相,％ ０ １５ ８５ ０􀆰５ １５ ８５ ２ ３ ９７ ４ ３ ９７ ５ １５ ８５ ６ １５ ８５ ８􀆰４􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI＋); b)　检测方式:多反应监测(MRM); c)　毛细管电压:２􀆰８kV; d)　离子源温度:１００℃; e)　去溶剂温度:３２０℃; f)　脱溶剂气体流量:６３０L/h; g)　碰撞气流量:３３L/h; 多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值见表２. 表２　多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值 待测物 监测离