2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 饲 料 中 黄 霉 素 A 的 测 定 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 6 8 3 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f m o e n o m y c i n A i n f e e d s — L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６８３—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:上海市质量监督检验技术研究院、上海市兽药饲料检测所. 本文件主要起草人::虞成华、严凤、卞华、黄士新、葛宇、吴剑平、陆志芸、黄家莺、郑国建、商军、张婧、 王博、陈晓薇、兰旭、张浩然. ⅠNY/T４６８３—２０２５ 　 　 　饲料中黄霉素A的测定　液相色谱串联质谱法 １　范围 本文件描述了饲料中黄霉素A的液相色谱－串联质谱测定方法. 本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中黄霉素A的测定. 本文件的检出限为０􀆰１mg/kg,定量限为０􀆰２５mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样中的黄霉素A用０􀆰１％甲酸甲醇溶液提取,经固相萃取净化,用液相色谱串联质谱仪检测,基质 匹配标准曲线校准,外标法定量. ５　试剂或材料 ５􀆰１　水:水为符合GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰２　甲醇:色谱纯. ５􀆰３　乙腈:色谱纯. ５􀆰４　甲酸:色谱纯. ５􀆰５　乙酸铵:色谱纯. ５􀆰６　乙酸铵溶液(２０mmol/L):称取１􀆰５４３g乙酸铵(５􀆰５)于９００mL水中,用甲酸(５􀆰４)调节pH至５􀆰０, 用水定容至１０００mL,混匀. ５􀆰７　０􀆰１％甲酸甲醇溶液(体积分数):取１mL甲酸(５􀆰４),加甲醇(５􀆰２)至１０００mL,混匀. ５􀆰８　标准储备溶液(１mg/mL):称取黄霉素A标准品(CAS:７６０９５Ｇ３９Ｇ１,纯度≥９７􀆰２％)１０mg(精确至 ０􀆰０１mg)于１０mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容.－１８℃以下保存,有效期６个月. ５􀆰９　标准中间溶液(１０μg/mL):准确移取１mL标准储备溶液(５􀆰８)于１００mL容量瓶中,用甲醇稀释、 定容,摇匀.－１８℃以下保存,有效期１个月. ５􀆰１０　亲水亲脂平衡性固相小柱:３mL/６０mg,或性能相当者. ５􀆰１１　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ６　仪器设备 ６􀆰１　液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI). ６􀆰２　分析天平:精度分别为０􀆰０１g和０􀆰０１mg. １NY/T４６８３—２０２５ ６􀆰３　涡旋振荡器. ６􀆰４　超声波清洗机. ６􀆰５　pH计:精度为０􀆰０１. ６􀆰６　离心机:转速不低于１００００r/min. ６􀆰７　氮吹仪. ７　样品 按GB/T２０１９５的规定制备样品,至少２００g,粉碎使其全部通过０􀆰４２５mm的试验筛,充分混匀,装 入密闭容器中,备用.选取类型相同,均匀一致且在黄霉素A保留时间处,仪器响应值小于方法定量限 ３０％的饲料样品,作为空白样品. ８　试验步骤 ８􀆰１　提取与净化 平行做２份试验.分别称取试样５g(精确至０􀆰０１g),置于５０mL离心管中,加入２５mL０􀆰１％甲酸 甲醇溶液(５􀆰７),涡旋振荡５min,超声５min,１００００r/min离心５min,取上清液置于５０mL容量瓶中,重 复提取一次,合并２次上清液,用０􀆰１％甲酸甲醇溶液(５􀆰７)定容至刻度,摇匀.准确移取２ml提取液过固 相萃取小柱(５􀆰１０),保持流速为１~２滴/秒,收集滤液,过微孔滤膜(５􀆰１１),待测. ８􀆰２　基质匹配标准系列溶液的制备 取空白样品,按８􀆰１处理得到空白基质溶液,取标准中间溶液(５􀆰９)适量,用空白基质溶液稀释,配制成 质量浓度分别为１０􀆰０ng/mL、５０􀆰０ng/mL、１００􀆰０ng/mL、２５０􀆰０ng/mL、５００􀆰０ng/mL和１０００􀆰０ng/mL的 基质匹配标准系列溶液. ８􀆰３　测定 ８􀆰３􀆰１　液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)　色谱柱:高纯度硅胶及双键键合C１８柱,１００mm×２􀆰１mm,粒径３􀆰０μm,或性能类似的色谱柱; b)流速:０􀆰４mL/min; c)柱温:３５℃; d)进样量:１０μL; e)流动相:A相为乙酸铵溶液(５􀆰６),B相为乙腈(５􀆰３),梯度洗脱程序见表１. 表１　梯度洗脱程序时间 时间min A相％ B相％ ０􀆰００ ９０ １０ １􀆰００ ９０ １０ １􀆰１０ ５ ９５ ４􀆰００ ５ ９５ ４􀆰１０ ９０ １０ ７􀆰００ ９０ １０ ８􀆰３􀆰２　质谱参考条件 质谱参考条件如下: a)　电离方式:电喷雾电离,负离子模式(ESI－); b)检测方式:多反应监测(MRM); c)电离电压:３􀆰０kV; ２NY/T４６８３—２０２５ d)源温度:１５０℃; e)脱溶剂气流速:１０００L/h; f)反吹气流速:１５０L/h; h)雾化器温度:５５０℃. 黄霉素A的多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值见表２. 表２　黄霉素A的多反应监测(MRM)离子对、锥孔电压及碰撞能量的参考值 被测物名称 监测离子对m/z 锥孔电压V 碰撞能量eV 黄霉素A７８９􀆰９＞５５３􀆰９ ２５ ３０ ７８９􀆰９＞５７５􀆰９a ２５ ２５ 　　a为定量离子. ８􀆰３􀆰３　基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配标准系列溶液(８􀆰２)和试样溶液(８􀆰１)上机测定.黄霉素A基 质匹配标准溶液定量离子色谱图见附录A. ８􀆰３􀆰４　定性 在相同试验条件下,试样溶液与基质匹配标准系列溶液(质量浓度相当)中黄霉素A的保留时间一 致,其相对偏差应在±２􀆰５％之内.根据表２选择的监测离子对,比较试样谱图中黄霉素A监测离子对的 相对离子丰度与质量浓度接近的基质匹配标准系列溶液中监测离子对的相对离子丰度,若偏差不超过表 ３规定的范围,则可判定为样品中存在黄霉素A.定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差见表３. 表３　定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 ＞５０ ＞２０~５０ ＞１０~２０ ≤１０ 最大允许偏差 ±２０ ±２５ ±３０ ±５０ ８􀆰３􀆰５　定量 以基质匹配标准系列溶液中黄霉素A的质量浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,其 相关系数应不低于０􀆰９９.试样溶液(８􀆰１)中黄霉素A的质量浓度应在标准曲线线性范围内.如超出范 围,重新试验.单点校准定量时,试样溶液中黄霉素A的质量浓度与基质匹配标准溶液的质量浓度相差 不超过３０％. ９　试验数据处理 试样中黄霉素A的含量以质量分数w计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示,多点校准按公式(１)计 算;单点校准按公式(２)计算. w＝ρ×V m×１０００(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: ρ　———由标准曲线得到的试样液中黄霉素A质量浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL); V———试样定容体积的数值,单位为毫升(mL); m———试样质量的数值,单位为克(g); １０００———换算系数. w＝A×ρs×V As×m×１０００(２) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: A　———试样溶液中黄霉素A的色谱峰面积; ρS———基质匹配标准溶液中黄霉素A质量浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL); ３NY/T４６８３—２０２５ V———试样提取溶液体积的数值,单位为毫升(mL); AS———基质匹配标准溶液中黄霉素A的峰面积; m———试样质量的数值,单位为克(g); １０００———换算系数. 测定结果以平行测定的算术平均值表示,保留３位有效数字. １０　精密度 在重复性条件下,２次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的２０％. ４NY/T４６８３—２０２５ 附　录　A (资料性) 黄霉素A基质匹配标准溶液定量离子色谱图 　 黄霉素A基质匹配标准溶液(１００ng/mL)定量离子色谱图见图A􀆰１. 　标引序号说明: 　１—黄霉素A. 图A􀆰１　黄霉素A基质匹配标准溶液(１００ng/mL)定量离子色谱图 ５