2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 混 合 型 饲 料 添 加 剂 酸 度 调 节 剂 中 有 机 酸 的 测 定 高 效 液 相 色 谱 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 6 8 5 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f o r g a n i c a c i d s i n a c i d i t y r e g u l a t o r s a s f e e d a d d i t i v e b l e n d e r — H i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６８５—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:四川威尔检测技术股份有限公司、通威农业发展有限公司、广东酸能生物科技有限 公司、上海正正生物技术有限公司. 本文件主要起草人:张凤枰、张艳红、易倩、杨发树、张璐、何谦泰、沈如香、李海蓉. ⅠNY/T４６８５—２０２５ 混合型饲料添加剂酸度调节剂中有机酸的 测定　高效液相色谱法 １　范围 本文件描述了混合型饲料添加剂酸度调节剂中有机酸的高效液相色谱测定方法. 本文件适用于粉末型、颗粒型、液体型和脂肪酸酯包被型混合型饲料添加剂酸度调节剂中柠檬酸、酒 石酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、富马酸、丙酸、丁酸(包括前述有机酸的盐),以及苯甲酸和山梨酸(不包括 其盐)的测定. 本文件柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸和丁酸的检出限均为０􀆰０２％、定量限均为 ０􀆰０６％,富马酸的检出限为０􀆰０００１％、定量限为０􀆰０００３％,苯甲酸和山梨酸的检出限均为０􀆰００１％、定量 限均为０􀆰００３％. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 用硫酸溶液超声提取试样中的柠檬酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸和丁酸,用甲醇 超声提取苯甲酸和山梨酸,高效液相色谱仪测定,外标法定量. ５　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ５􀆰１　水:GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰２　甲醇:色谱级. ５􀆰３　硫酸溶液Ⅰ(３０mmol/L):量取１􀆰７mL硫酸,缓慢注入至７００mL水中,边加入边搅拌,冷却至室 温,用水稀释至１０００mL,混匀. ５􀆰４　氢氧化钠溶液(５mol/L):称取２００g氢氧化钠,缓慢加入约７００mL水,搅拌、溶解,冷却至室温,用 水稀释至１０００mL,混匀. ５􀆰５　硫酸溶液Ⅱ:量取２００mL硫酸,缓慢注入至７００mL水中,边加入边搅拌,冷却至室温,用水稀释至 １０００mL,混匀. ５􀆰６　磷酸盐缓冲溶液:称取２􀆰５g无水磷酸二氢钾和２􀆰５g三水合磷酸氢二钾,加入适量水溶解,用水定 容至１０００mL,混匀. ５􀆰７　有机酸标准品:柠檬酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、苯甲酸和山梨酸等１１ 种有机酸标准品的CAS号、纯度等见附录A. ５􀆰８　柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、富马酸、丙酸、丁酸标准储备溶液(５mg/mL):准确称取 柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、富马酸、丙酸和丁酸标准品各约５０mg(精确至０􀆰０１mg),分别置于 １０mL容量瓶中,用硫酸溶液Ⅰ(５􀆰３)溶解、定容,混匀.于２℃~８℃保存,有效期３个月. １NY/T４６８５—２０２５ ５􀆰９　苯甲酸、山梨酸标准储备溶液(１mg/mL):准确称取苯甲酸、山梨酸标准品各约５０mg(精确至 ０􀆰０１mg),分别置于５０mL容量瓶中,用甲醇(５􀆰２)溶解、定容,混匀.于２℃~８℃保存,有效期６个月. ５􀆰１０　富马酸标准中间溶液(２００μg/mL):准确移取１mL富马酸标准储备溶液(５􀆰８)于２５mL容量瓶 中,用硫酸溶液Ⅰ(５􀆰３)稀释、定容,混匀.临用现配. ５􀆰１１　柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸混合标准系列溶液:准确移取适量柠檬酸、 酒石酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸储备溶液(５􀆰８),用硫酸溶液Ⅰ(５􀆰３)稀释定容,配制成质 量浓度分别为５μg/mL、１０μg/mL、２５μg/mL、５０μg/mL、１００μg/mL、５００μg/mL混合标准系列溶液. 临用现配. ５􀆰１２　富马酸标准系列溶液:准确移取适量富马酸标准中间溶液(５􀆰１０),用硫酸溶液Ⅰ(５􀆰３)稀释定容,配 制成质量浓度分别为０􀆰２μg/mL、０􀆰４μg/mL、１μg/mL、２μg/mL、４μg/mL、２０μg/mL富马酸标准系列 溶液.临用现配. 注:因苹果酸标准品中含有一定量的富马酸,同时富马酸的响应比其他８种有机酸高两个数量级,因 此需要单独配制富马酸标准系列溶液,以免影响试样溶液中富马酸的定量. ５􀆰１３　苯甲酸、山梨酸混合标准系列溶液:分别准确移取适量苯甲酸、山梨酸储备溶液(５􀆰９),用磷酸盐缓 冲溶液(５􀆰６)稀释、定容,配制成质量浓度分别为０􀆰５μg/mL、２μg/mL、１０μg/mL、２０μg/mL、５０μg/mL、 １００μg/mL苯甲酸、山梨酸混合标准系列溶液.临用现配. ５􀆰１４　微孔滤膜:０􀆰４５μm,水系. ５􀆰１５　微孔滤膜:０􀆰４５μm,有机系. ６　仪器设备 ６􀆰１　高效液相色谱仪:配紫外检测器或二极管阵列检测器. ６􀆰２　分析天平:精度为０􀆰１mg和０􀆰０１mg. ６􀆰３　超声波清洗器. ６􀆰４　pH计:精度为０􀆰０１,或使用pH１􀆰４~３􀆰０的精密试纸. ７　样品 取代表性的样品２００g,尽快装入耐酸、耐腐蚀的容器中,立即密封,尽快分析. ８　试验步骤 ８􀆰１　试样提取 ８􀆰１􀆰１　柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、富马酸、丙酸和丁酸 ８􀆰１􀆰１􀆰１　粉末型、颗粒型和液体型 平行做２份试验.称取０􀆰５g~２g试样,精确至０􀆰１mg,置于２５０mL三角瓶中,加入６０mL硫酸溶 液Ⅰ(５􀆰３),超声提取２０min,冷却至室温.若需要检测乳酸含量,称样后加入３０mL~４０mL水、４mL 氢氧化钠溶液(５􀆰４),超声提取２０min,冷却至室温,用硫酸溶液Ⅱ(５􀆰５)调pH至１􀆰８~２􀆰０.转移至 １００mL容量瓶中,用少许硫酸溶液Ⅰ(５􀆰３)冲洗三角瓶３次~５次,洗液并入容量瓶中,用硫酸溶液Ⅰ (５􀆰３)稀释、定容,摇匀,过微孔滤膜(５􀆰１４),备用. 注:高浓度乳酸常发生脱水生成丙交酯,需用强碱皂化. ８􀆰１􀆰１􀆰２　脂肪酸酯包被型 除超声温度为８０℃外,其他同８􀆰１􀆰１􀆰１. ８􀆰１􀆰２　苯甲酸和山梨酸 平行做２份试验.称取０􀆰５g~２g试样,精确至０􀆰１mg,置于１００mL容量瓶中,加入１０mL甲醇 (５􀆰２),超声提取２０min,冷却至室温,用磷酸盐缓冲溶液(５􀆰６)稀释、定容,摇匀,过微孔滤膜(５􀆰１５), ２NY/T４６８５—２０２５ 备用. ８􀆰２　测定 ８􀆰２􀆰１　高效液相色谱参考条件Ⅰ 高效液相色谱参考条件Ⅰ如下: a)　色谱柱:离子排斥色谱柱如BioＧRadAminexHPXＧ８７H,长３００mm,内径７􀆰８mm,粒径９μm,或 性能相当者; b)　流动相:３０mmol/L硫酸溶液Ⅰ(５􀆰３); c)　流速:０􀆰６mL/min; d)　柱温:３２℃; e)　检测波长:２１０nm; f)　进样量:２０μL. 注:BioＧRadAminexHPXＧ８７H离子排斥色谱柱是适合的市售产品的实例.给出这一信息是为了方 便本文件的使用者,并不表示对该产品的认可. ８􀆰２􀆰２　高效液相色谱参考条件Ⅱ 高效液相色谱参考条件Ⅱ如下: a)　色谱柱:C１８柱,柱长２５０mm,内径４􀆰６mm,粒径５μm,或性能相当者; b)　流动相:甲醇(５􀆰２)＋磷酸盐缓冲溶液(５􀆰６)＝１０＋９０; c)　流速:１􀆰０mL/min; d)　柱温:３０℃; e)　检测波长:２３０nm; f)　进样量:２０μL. ８􀆰２􀆰３　标准系列溶液和试样溶液测定 在仪器的最佳条件下,按照高效液相色谱参考条件Ⅰ,取柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙 酸、丁酸混合标准系列溶液(５􀆰１１)、富马酸标准系列溶液(５􀆰１２)和试样溶液(８􀆰１􀆰１)上机测定,柠檬酸、酒 石酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸标准溶液的液相色谱图见附录B的B􀆰１,富马酸液相色谱图见 B􀆰２;按照高效液相色谱参考条件Ⅱ,取苯甲酸和山梨酸混合标准系列溶液(５􀆰１３)和试样溶液(８􀆰１􀆰２),上 机测定,苯甲酸和山梨酸标准溶液的液相色谱图见B􀆰３. ８􀆰２􀆰４　定性 以保留时间定性,试样溶液中各种有机酸的保留时间应与质量浓度相当标准系