2 0 2 5 0 1 0 9 发 布 － － 2 0 2 5 0 5 0 1 － － 实 施 直 接 饲 喂 微 生 物 和 发 酵 制 品 类 饲 料 添 加 剂 生 产 菌 株 细 菌 菌 种 鉴 定 分 子 生 物 学 方 法 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 6 8 6 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f d i r e c t - f e d m i c r o o r g a n i s m s a n d p r o d u c t i o n s t r a i n s o f f e r m e n t e d - p r o d u c t s f o r f e e d a d d i t i v e s - B a c t e r i a s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n — M o l e c u l a r b i o l o g i c a l m e t h o d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４６８６—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:中国食品发酵工业研究院有限公司、全国畜牧总站、深圳华大智造科技股份有限公 司、北京首钢朗泽科技股份有限公司. 本文件主要起草人:姚粟、胡广东、丁健、程坤、曹艳花、刘艺茹、王荃、张欣、蒋慧、邹方起、张娜、葛媛 媛、孙思佳、冯会粉、刘蕊、刘红强、杨自飞、李重阳、蒋晓莹. ⅠNY/T４６８６—２０２５ 直接饲喂微生物和发酵制品类饲料添加剂 生产菌株　细菌菌种鉴定分子生物学方法 １　范围 本文件描述了直接饲喂微生物饲料添加剂菌株和发酵制品类饲料添加剂生产菌株中细菌菌种的分子 生物学鉴定方法,包括平均核苷酸一致性(ANI)鉴定法和基因序列鉴定法. 本文件平均核苷酸一致性(ANI)鉴定法适用于已批准或拟申报的直接饲喂微生物饲料添加剂菌株和 发酵制品类饲料添加剂生产菌株中细菌菌种的鉴定.基因序列鉴定法适用于附录A中所列细菌菌种的 鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T８１７０　数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB１９４８９　实验室生物安全通用要求 GB/T２７４０３　实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T３７８７４—２０１９　核酸提取纯化方法评价通则 ３　术语、定义和缩略语 ３􀆰１　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１􀆰１　 直接饲喂微生物饲料添加剂　directＧfedmicroorganismsfeedadditives 在饲料中添加或直接饲喂给动物的活的微生物饲料添加剂. ３􀆰１􀆰２　 发酵制品类饲料添加剂　fermentedproductsforfeedadditives 微生物在受控制条件下,通过生命活动生产的特定代谢产物经分离、提取、纯化、精制和干燥等工艺制 成的饲料添加剂,如氨基酸、维生素、酶制剂等. ３􀆰１􀆰３　 菌种鉴定　speciesidentification 通过分析菌株的分子特征,确定菌株分类地位的过程. ３􀆰１􀆰４　 测序深度　depthofsequencing 菌株基因组中某个指定的核苷酸被检测的次数. ３􀆰１􀆰５　 叠连群　contig 测序得到的DNA片段,根据相互间的重叠性,构成的一个长的无缺失的DNA片段. [来源:GB/T２９８５９—２０１３,２􀆰４􀆰１４] ３􀆰２　缩略语 下列缩略语适用于本文件. １NY/T４６８６—２０２５ ANI:平均核苷酸一致性(AverageNucleotideIdentity) bp:碱基对(basepair) DDBJ:日本DNA数据库(DNADataBankofJapan) DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid) EMBL:欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory) gyrB:DNA旋转酶B亚基编码基因(DNAgyrasesubunitBencodinggene) ICNP:原核生物国际命名法规(InternationalCodeofNomenclatureofProkaryotes) NCBI:美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation) PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction) pheS:苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基编码基因(phenylalanyl－tRNAsynthasealphasubunitencoＧ dinggene) rRNA:核糖体核糖核酸(ribosomalRNA) ４　试剂或材料 ４􀆰１　细菌基因组DNA提取试剂盒. ４􀆰２　文库制备试剂. ４􀆰３　高通量测序试剂. ４􀆰４　TE缓冲液. ４􀆰５　PCR扩增试剂盒. ４􀆰６　２×PCR预混液. ４􀆰７　引物:引物序列见７􀆰２􀆰２􀆰１和７􀆰２􀆰３􀆰２. ４􀆰８　无菌双蒸水. ４􀆰９　琼脂糖. ４􀆰１０　１×TAE缓冲液. ４􀆰１１　荧光核酸染料. ４􀆰１２　DNA分子量标记物(１００bp~２０００bp). ４􀆰１３　阳性对照菌株:枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCICC１０４９８T(＝ACCC１０２４３T)、嗜酸乳杆菌LacＧ tobacillusacidophilusCICC６０９６T(＝ACCC１９９４０T). ５　仪器设备 试验设施和设备应符合GB１９４８９的规定,试验环境条件应按GB/T２７４０３的规定执行. ５􀆰１　生物安全柜. ５􀆰２　核酸定量仪. ５􀆰３　高通量基因测序仪. ５􀆰４　恒温水浴锅:３７℃±１℃、５５℃±１℃. ５􀆰５　离心机:最高转速１５０００r/min. ５􀆰６　PCR仪. ５􀆰７　核酸电泳仪. ５􀆰８　凝胶电泳成像系统. ６　平均核苷酸一致性(ANI)鉴定法 ６􀆰１　原理 采用高通量测序技术测定菌株基因组序列,并与近缘模式菌株基因组序列进行比对,计算ANI值,实 ２NY/T４６８６—２０２５ 现菌株的鉴定. ６􀆰２　试验步骤 ６􀆰２􀆰１　待鉴定菌株基因组DNA提取 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待鉴定菌株基因组DNA.DNA的纯度应符合GB/T３７８７４ 的要求,DNA的浓度和总量应符合文库构建的相关要求.提取的基因组DNA于－２０℃保存,备用. ６􀆰２􀆰２　基因组测序和序列质控 采用第二代测序技术,或第二代和第三代测序技术相结合,测定待鉴定菌株基因组序列,获得基因组 框架图或完成图.原始序列经分析软件比对和组装,获得待鉴定菌株的基因组序列. ６􀆰２􀆰２􀆰１　基因组序列应从测序深度、叠连群(contig)数量和序列总长度三方面进行质控,并同时满足以 下条件,否则应重新进行测序. a)　测序深度≥５０×; b)　叠连群(contig)数量不超过５００个; c)　基因组序列总长度与最大相似度模式菌株基因组序列大小的差异≤２０％. ６􀆰２􀆰３　ANI分析 ６􀆰２􀆰３􀆰１　从待鉴定菌株基因组序列中获得其１６SrRNA基因序列并与核酸序列数据库(如NCBI、EMＧ BL、DDBJ等)中近缘种模式菌株的１６SrRNA基因序列进行比对,获得序列相似性.数值按GB/T８１７０ 的修约值比较法执行. ６􀆰２􀆰３􀆰２　从NCBI等公共数据库下载与待鉴定菌株１６SrRNA基因序列相似性大于９８􀆰６５％的近缘种模 式菌株基因组序列.利用ANI分析软件,计算待鉴定菌株与近缘种模式菌株之间基因组序列的ANI值. ６􀆰３　结果判定 根据６􀆰２􀆰３􀆰２计算所得的ANI值进行如下结果判定: a)　当待鉴定菌株与某种近缘种模式菌株之间基因组序列的ANI值大于９６％时,判定待鉴定菌株与 该近缘种模式菌种为同一种; b)　当待鉴定菌株与所有近缘种模式菌株之间基因组序列的ANI值都小于９５％时,则待鉴定菌株 无法判定为已知菌种; d)　当待鉴定菌株与近缘种模式菌株之间基因组序列的ANI值在９５％~９６％时,则宜结合本文件 之外的其他方法(如数字DNA—DNA杂交、表型分析等)进行综合判定. ７　基因序列鉴定法 ７􀆰１　原理 细菌菌种首先通过PCR获得１６SrRNA基因序列,与近缘种模式菌株基因序列进行比对,根据序列 相似性及系统发育分析,对菌种进行鉴定.通过１６SrRNA基因序列无法鉴定至种水平的菌种,应进一步 进行gyrB或pheS基因序列分析,并结合１６SrRNA和gyrB基因序列,或１６SrRNA和pheS基因序列 实现种水平鉴定. ７􀆰２　试验步骤 ７􀆰２􀆰１　待鉴定菌株基因组DNA提取 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待鉴定菌株基因组DNA.也可采用手工提取的方法:取新鲜 培养的菌液１mL,１００００r/min离心２min.沉淀用TE缓冲液１００μ