2 0 2 3 0 2 1 7 发 布 － － 2 0 2 3 0 6 0 1 － － 实 施 猪 传 染 性 胸 膜 肺 炎 诊 断 技 术 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 5 3 7 — 2 0 2 3 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r p o r c i n e c o n t a g i o u s p l e u r o p n e u m o n i a Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布 代 替 N Y / T 5 3 7 — 2 0 0 2NY/T５３７—２０２３ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规 定起草. 本文件代替NY/T５３７—２００２«猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术».与NY/T５３７—２００２相比,除结构 调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a)　增加了“缩略语”(见第４章); b)增加了“临床诊断”(见第５章); c)增加了“PCR检测”(见第８章); d)增加了“实时荧光PCR检测方法”(见第９章); e)增加了“综合结果判定说明”(见第１２章); f)增加了“胸膜肺炎放线杆菌形态图”(见附录B); g)删除了“补体结合试验”(见２００２年版的第４章); h)修改了“酶联免疫吸附试验”(见第１１章,２００２年版的第６章). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:中国动物卫生与流行病学中心、河南科技大学、江苏省农业科学院、广西壮族自治区 动物疫病预防控制中心、山东畜牧兽医职业学院、青岛市即墨区畜牧业发展服务中心. 本文件主要起草人:魏荣、张慧、周俊明、汪洋、盖文燕、徐天刚、刘丽蓉、孙翔翔、王岩、魏甜甜、董雅琴、 刘爽、倪艳秀、吴发兴、何奇松、熊毅. 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———２００２年首次发布为NY/T５３７—２００２; ———本次为第一次修订. ⅠNY/T５３７—２０２３ 引　　言 猪传染性胸膜肺炎(porcinepleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种猪的急性呼吸道传 染病.发病猪以急性出血性纤维素性肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜炎为主要特征.急性病例病死率 高,慢性病例能耐过,表现出消瘦和生长发育不良.目前,该病在世界上养猪国家广泛存在. 胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)属于巴氏杆菌科放线杆菌属.根据对辅 酶Ⅰ(NAD)的依赖性,分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型;根据荚膜多糖及脂多糖的抗原性差异,目前将本菌分为 １９个血清型.通常１~１２、１５~１９型为生物Ⅰ型,生物需要依赖NAD,大多数１３型和１４型属于生物Ⅱ 型,生长不依赖NAD.不同血清型甚至同一血清型中不同菌株之间的毒力有差异,一般１型、５型、９型及 １１型毒力最强,２型、３型、６型、８型、１２型及１５型为中等毒力或低毒力.我国APP主要流行血清型为１ 型、２型、３型、４型、５型、７型. ⅡNY/T５３７—２０２３ 猪传染性胸膜肺炎诊断技术 １　范围 本文件规定了猪传染性胸膜肺炎临床诊断、样品采集和运送、病原分离与鉴定、PCR检测、实时荧光 PCR检测、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验的技术要求和规范. 本文件适用于猪传染性胸膜肺炎的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件. NY/T５４１　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 卫星现象　Satellitephenomenon 挑取APP菌落接种于血琼脂表面,用金黄色葡萄球菌点种或垂直划线,在３７℃５％~１０％CO２条件 下培养２４h~４８h.越靠近金黄色葡萄球菌菌落生长的本菌菌落越大,越远的越小甚至不见菌落生长,即 所谓“卫星现象”,也称V因子需要试验. ３􀆰２ β溶血　βhemolysis 菌落周围形成完全透明的溶血环,红细胞完全溶解,称为β溶血.相对的,在菌落周围形成不透明的 草绿色溶血环,红细胞未溶解,血红蛋白变成绿色,称为α溶血. ３􀆰３　 胸膜肺炎放线杆菌含重复子毒素　Actinobacilluspleuropneumoniae　RTX,Apx APP可产生４种毒素,分别为ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ,均为重要的毒力因子,具有细胞毒性或 溶血性,是一种穿孔毒素,属于含重复子毒素(repeatsintoxin,RTX)家族.其中,ApxⅣ存在于所有血清 型,且只在猪体内产生. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. APP:胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae) PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateＧbufferedsalinebuffer) TSB:胰蛋白大豆肉汤(Trypticasesoybroth) NAD:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,也称V因子(Nicotinamideadeninedinucleotide) CAMP:协同溶血试验(ChristisＧAtkinsＧMunchＧpeterson) Apx:胸膜肺炎放线杆菌含重复子毒素(Actinobacilluspleuropneumoniae　RTX) PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction) DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(DeoxyＧribonucleosidetriphosphate) TE:TrisＧEDTA缓冲液(TrisＧEDTAbuffer) １NY/T５３７—２０２３ TAE:TAE缓冲液(TrisＧaceticＧEDTAbuffer) ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzymelinkedimmunesorbentassay) HRP:辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase) TMB:３,３′,５,５′Ｇ四甲基联苯胺(３,３′,５,５′ＧTetramethylbenzidine) IPTG:异丙基ＧβＧDＧ硫代半乳糖苷(IsopropylＧbetaＧDＧthiogalactopyranoside) ５　临床诊断 ５􀆰１　流行病学 ５􀆰１􀆰１　易感动物 对猪具有高度宿主特异性,各年龄猪均易感. ５􀆰１􀆰２　传染源 带菌猪、病猪及其分泌物是本病的传染源.病菌主要存在于肺脏病变部位、扁桃体、支气管、鼻分泌 物中. ５􀆰１􀆰３　传播途径 主要传播途径是通过猪与猪的直接接触或短距离飞沫传播. ５􀆰１􀆰４　流行特点 一年四季均可发生,秋末春初季节变化时多发.饲养环境突然改变、密集饲养、通风不良、气候突变及 长途运输等诱因可引起本病.猪场或猪群之间的传播,多由引进或混入带菌猪、慢性感染猪所致,集约化 猪场往往呈跳跃式急性暴发,死亡率高. ５􀆰２　临床症状 ５􀆰２􀆰１　最急性型 本病临床症状因动物的年龄、免疫状态、疫病状态、环境因素及对病原的易感程度等不同而呈现差异. 猪群中一头或几头猪只突然发病.体温升高达４１℃~４２℃,并可出现短期呕吐.鼻、耳、眼及后躯皮肤 常发绀,最后阶段出现严重呼吸困难,临死前常从口、鼻流出血性泡沫状分泌物.有时未见任何症状即突 然死亡. ５􀆰２􀆰２　急性型 病猪体温升高,可达４０􀆰５℃~４１℃,精神委顿,喜卧少动,饮食不振.有咳嗽、喘气、呼吸困难等严重 呼吸道症状. ５􀆰２􀆰３　亚急性型或慢性型 病猪体温可能无明显变化,常呈现间歇性咳嗽,呼吸异常、食欲不振、增重减少.疾病暴发初期,母猪 常出现流产(可能由发热引起).个别猪只出现中耳炎.若混合感染猪流感病毒、巴氏杆菌、支原体等其他 呼吸道病原时,病程恶化,病死率明显增加. ５􀆰３　病理特征 ５􀆰３􀆰１　剖检后的眼观变化主要是纤维素性肺炎,可呈单侧、双侧、大叶性、弥漫性或多灶性,肺炎区色深, 有出血点或斑块状出血,中等硬度,略有弹性,急性、亚急性和慢性病例可见肺部纤维素性渗出物. ５􀆰３􀆰２　纤维素性胸膜炎明显,急性和慢性病例均可见胸腔含有带血色的液体,胸膜有粘连区,气管和支气 管充满带血色的黏液性泡沫分泌物. ５􀆰３􀆰３　组织学变化以肺组织坏死、出血、中性粒细胞浸润、血管栓塞、广泛水肿和纤维素性渗出为特征,坏 死区周围发生巨噬细胞浸润和纤维化. ５􀆰４　结果判定 易感动物出现５􀆰２􀆰１或５􀆰２􀆰２或５􀆰２􀆰３至少一项临床症状且符合５􀆰１流行病学及５􀆰３病理特征,判 定为APP感染疑似病例. ２NY/T５３７—２０２３ ６　样品采集和运送 ６􀆰１　耗材 ６􀆰１􀆰１　无菌棉拭子. ６􀆰１􀆰２　灭菌管. ６􀆰１􀆰３　医用防护服. ６􀆰２　试剂 ６􀆰２􀆰１　PBS,按照附录A中A􀆰１描述的方法配制. ６􀆰２􀆰２　３０％甘油磷酸盐缓冲液,按照A􀆰２描述的方法配制. ６􀆰３　活体病料采集 按照NY/T５４１规定的方法采样.用棉拭子伸入鼻腔采集分泌物,将该鼻拭子样品端置于含有