ICS 65.020.01 V 53 T/ZNZ 浙江省农产品质量安全学会团体标准 T/ZNZ 021—2020 水稻对稻曲病抗性 鉴定技术 规程 Code of practice for evaluation of rice r esistance to rice false smut 2020-05-15发布 2020-06-15实施 浙江省 农产品质量安全学会 发布 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 021 -2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。 本标准起草单位： 中国水稻研究所 。 本标准主要起草人： 黄世文、王玲、刘连盟。 本标准为首次发布。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 021 -2020 1 水稻对稻曲病抗性 鉴定技术规 程 1 范围 本标准规定了水稻 品种、材料对稻曲病（ Villosiclava virens ）抗性鉴定的术语和定义、试剂材 料、设备、鉴定方法及评价标准 。 本标准适用于 水稻品种、材料对稻曲病的抗性 鉴定和抗性评价 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4404.1 粮食作物种子 第1部分 禾谷类 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8321 （所有部分） 农药合理使用准则 NY/T 496 肥料合理使用准则 通则 NY/T 1276 -2007 农药安全使用规范 总则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 分离物 isolate 从发病部位通过人工培养、纯化、再接种和分离等方法获得病原物的培养物。 3.2 剑叶叶枕距 flag leaf pulvinus interval 水稻剑叶从倒二叶的叶鞘中抽出后，剑叶叶枕与倒二叶叶枕之间的距离 。剑叶叶枕高于倒二叶叶枕 时，为正叶枕距；剑叶叶枕低于倒二叶叶枕时，为负叶枕距。 4 试剂与材料 本标准所用试剂在未加说明时均采用分析纯试剂。 实验室用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水要 求。 4.1 PSA培养基 称取 200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加入 1000 mL水，煮沸 20 min，纱布过滤，补水至 1000 mL， 再加入蔗糖 20 g和琼脂 20 g，搅拌均匀，高压灭菌（ 121℃，20 min）。 4.2 PSB培养基 称取 200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加入 1000 mL水，煮沸 20 min，纱布过滤，补水至 1000 mL， 加入蔗糖 20 g，搅拌均匀，高压灭菌（ 121℃，20 min）。 4.3 WA培养基 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 021 -2020 2 琼脂 20 g，用水定容至 1000 mL，高压灭菌（ 121℃，20 min）。 5 仪器设备 5.1 恒温培养箱 5.2 光学显微镜 5.3 超净工作台 5.4 高压灭菌锅 5.5 振荡摇床 5.6 电子天平 5.7 组织捣碎机 5.8 医用注射器 6 接种体制备 6.1 病原菌分离、纯化与保存 6.1.1 病原菌分离 以常规组织分离法从稻曲球上获得分离物。在超净工作台上切除稻曲球外层组织，将最内层的白色 部分切成约 0.2 cm × 0.3 cm的病组织块，先用 75 %乙醇溶液消毒 15 s，再用灭菌的三级水冲洗 3次， 无菌滤纸吸干后置于 PSA平板上，恒温培养箱中 28℃培养。 6.1.2 病原菌纯化 分离物培养 7 d以后，从生长的白色菌落边缘挑取少量菌丝转入新的 PSB培养基上。在 28 ℃下， 150 rpm，振荡培养 5 d ~ 7 d 后，用灭菌水配成每 毫升含 1×104个分生孢子的悬浮液。吸取 100 µL悬 浮液均匀涂布于 WA培养基上，在超净工作台中吹干。 28℃条件下培养至分生孢子萌发，在光学显微 镜下镜检，挑取萌发的单个分生孢子置于新的 PSA培养基上， 28℃恒温培养，并保存备用。 6.1.3 病原菌保存 将待保存的菌株接种在 PSA培养基上，周围摆放灭菌的滤纸片， 28℃恒温培养，待菌丝长过滤纸 片，用镊子将滤纸片揭下，装入灭菌的硫酸纸袋，置于装有硅胶的容器中干燥，再将硫酸纸袋密封，并 装入灭菌的牛皮纸袋，于 -20℃低温保存。 6.2 病原菌鉴定 依据病原菌形态和部分基因序列对接种用的 菌株进行鉴定，应符合附录 A的规定。 6.3 接种体制备 6.3.1 接种体选择 接种应采用当地致病力较强的稻曲病菌株。 6.3.2 接种体繁殖 将稻曲病菌株 移植到 PSA培养基的正中央 ，置于恒温培养箱 28℃培养 10 d。在无菌条件下用直径 5 mm的灭菌打孔器， 自菌落边缘切取菌饼 3块，接种于 100 mL的PSB液体培养基中。 在黑暗条件下， 28℃， 150 rpm，振荡培养 5 d ~ 7 d后，获得大量菌丝和薄壁分生孢子。将振荡培养液倒入组织捣碎机，高速打 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 021 -2020 3 碎菌丝， 形成菌丝片段与薄壁分生孢子的混合液， 用灭菌的 PSB培养基调整每毫升含 5×105个分生孢子， 作为接种物以备用 。 7 稻曲病抗性 鉴定 7.1 鉴定室 鉴定室应具备人工调节温度、湿度和光照的条件，有利于接种后植株所需的发病环境。 7.2 鉴定材料 的种植 7.2.1 种子质量 鉴定材料种子质量应符合 GB 4404.1 常规稻或杂交稻一级种标准，不应带检疫性病虫。 7.2.2 对照品种 鉴定时设附录 B中已知抗病和感病的材料为对照品种，或在相应生态类型区内选用当地生产上具有 代表性的已知抗性品种为对照。 7.2.3 鉴定设计 鉴定材料随机排列或顺序排列， 每50份~100份鉴定材料设 1组已知抗病和感病对照品种。每份鉴定 材料重复 3次，每一重复 15株。 7.2.4 鉴定材料育 苗 选择饱满度一致的鉴定材料种子，经 3%双氧水浸种 1 d后，用清水冲洗后再浸种 2 d，放入垫有两 层湿润滤纸的培养皿中，然后于 30 ℃恒温培养箱中 催芽。待胚根长至 0.5 cm时，选择芽长一致的种子 播于直径为 40 cm、高度为 34 cm的塑料盆中。每盆播种 3粒健康饱满的萌发种子，表层覆土 1 cm。在 18℃~ 28℃的自然光照下育苗，幼苗应生长健壮、一致。 7.2.5 鉴定材料 管理 土壤肥力水平和耕作管理与大田生产相同。 肥料施用应符合 NY/T 496 的规定。 农药使用应符合 GB/T 8321、NY/T 1276 -2007的规定。鉴定材料在全生育期内不使用杀菌剂，接种前后避免施用任何药剂。 7.3 接种 7.3.1 接种时期 接种时期为水稻剑叶叶枕距 2 cm ~8 cm（该时期为幼穗发育的花粉内容充实期），在傍晚 16:00 ~ 18:00接种。 7.3.2 接种方法 采用注射接种方法。 将孢子菌丝混合液注射入穗苞中部， 直至穗苞中充满菌液， 并从穗尖溢出为宜。 每份鉴定材料重复 3次，每一重复接种 15株，每株 1个穗子，且接种稻穗生育进程基本一致。 7.3.3 接种后管理 接种后将水稻置于 22℃~25℃的可控温室中，相对湿度（ RH）95%以上， 12 h/ 12 h光暗交替条件下 培养 3 d后，置于温度为 25℃~28℃，相对湿度（ RH）90%的可控温室中继续培养。 7.4 病情调查 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 021 -2020 4 7.4.1 调查时间 水稻腊熟期转黄熟期 。 7.4.2 调查与记载 对每份鉴定材料病害发生情况进行调查，记录发病最重的 10株单穗病粒数，作为鉴定材料的病情 级别，原始数据记载采用附录 C的表C.1。 7.4.3 稻曲病病情级别划分 稻曲病病情级别及其相对应的症状描述见表 1。 表1 稻曲病病情级别的划分 病情级别 单穗病粒数 0 穗子上无病粒 1 每穗病粒数 1个 3 每穗病粒数 2个 ~ 4个 5 每穗病粒数 5个 ~ 8个 7 每穗病粒数 9个 ~ 15个 9 每穗病粒数 ≥ 16个 7.5 病情指数计算 根据病情症状描述，按照公式（ 1）计算每份鉴定材料的病情指数（ DI）。 ()100Bi BdDIM Md ………………………………………………… （1） 式中： DI — 病情指数； Bi — 各级病穗数； Bd — 病情级别； M — 调查总穗数； Md — 严重度最高病情级别。 7.6 抗病性评价 7.6.1 抗病性评价标准 依据鉴定材料 3次重复的病情指数（ DI）的平均值确定其抗病性水平，划分标准见表 2。 表2 水稻对稻曲病抗性的评价标准 病情指数（ DI） 抗性评价 0.0 ≤ DI ≤ 5.0 高抗 Highly resistant （HR） 5.0 ＜ DI ≤ 10.0 抗病