SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3756—2013 玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法 PCR 方法 Detection and identification of Pantoea stewartii(Smith) Mergaert et al.- PCR method 2013-11-06发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3756-2013 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准参考了EPPOPM7/60（1）DiagnosticprotocolforPantoeastewartiisubsp.stewartii- PCR test。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、大连市产品质量监督检验院。 本标准主要起草人：王金玲、王有福、贾东、张莹、李俊环、李成铺、贾金生、李炎、刘文博、侯天亮。 - SN/T3756—2013 玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法 PCR方法 1范围 本标准规定了进境玉米检疫中玉米细菌性枯萎病菌的常规PCR鉴定方法。 本标准适用于进境种用及其他用途玉米中玉米细菌性枯萎病菌的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1375玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法， 3玉米细菌性枯萎病菌分类地位 学名：Pantoeasteartii(Smith）Mergaertetal. 异名：Pantoea steartii subsp.steuartiiKanthomonds stewartii;Aplanobacter steuartii;Bacillus ste- artii;Bacterium steuwartii;Phytomong udobucterium eartii;Pseudomonassteuartii; Erwinia stewarti 分类地位：原核生物界（Procarfotae），薄/壁菌门（Gracilicute），肠杆菌科（Enterobacteriaceae），泛 菌属（Pantoea）。 4方法原理 PCR方法的原理：提取细菌基因组DNA后，利用特异性物，通过PCR扩增得到特异性目的基因 片段，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：依据检测结果判定是否是自的细菌。 5仪器设备 5.1小型粉碎机。 5.2恒温培养箱：30℃±1℃。 5.3高压灭菌锅。 5.4PCR扩增仪。 5.5PCR超净工作台。 5.6电泳仪。 5.7 核酸/蛋白分析仪。 5.8 凝胶成像系统。 5.9 台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 SN/T37562013 5.10电子天平（感量0.01g）。 5.11微量加样器（2.5μL、10μL、20μL、200μL、1000μL)。 5.12无菌涂布棒。 5.13无菌培养皿：直径90mm。 6试剂 6.1 实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。 6.2 改良W氏培养基：见附录A中A.1。 6.3 TaqDNA聚合酶。 6.4dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP. 6.5 510×PCR缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH8.4),500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2。 6.6 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（pH值7.2)：见A.2。 6.7TE缓冲液(pH值8.0)：见A.3。 6.8 细菌基因组DNA提取试剂盒。 6.9 50×TAE缓冲液（pH值8.5)：见A.4。 6.10 琼脂糖。 6.11 溴化乙锭。 6.12 DNA分子量标记：100bpDNAladder。 7 PCR凝胶电泳检测 7.1样品处理 从待检样品中挑选不成熟、皱缩、有穗轴及色泽较深的籽粒作为检验样品。每份检验样品应不少于 0.25kg。待检样品在0.25kg以上、1kg以下的，检验样品可适当减少，但不得低于0.125kg。 样品用0.1%升汞（HgCI)溶液表面消毒处理1min~2min，或3%～5%的次氯酸钠（NaOC1)表面 消毒处理5min～15min，然后用无菌水冲洗3次，无菌条件下晾干。对于药剂拌种的样品，可用95% 乙醇洗去表面药剂后，再用无菌水冲洗3次，无菌条件下晾干。 消毒后的种子样品用粉碎机粉碎，称取20g，加人40mLPBS缓冲液（pH7.2)混匀，4℃过夜。 7.2病菌分离 在无菌条件下取悬浊液1ml，用无菌生理盐水以十倍系列稀释法稀释到1：10000。取每个浓度 的稀释液100μL于改良W氏培养基上，用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面，共接种5～10个 改良W氏培养基平板。将平板置于30℃土1℃培养48h～72h，观察菌落的出现情况。从中选取淡黄 色或黄色的、稍隆起、油质状、边缘整齐、生长迅速、半透明且有较大黏性的菌落。将剩下的浸泡液收集 起来放入灭菌的容器中，将其保存在4℃或放在冰上，当出现疑似结果时，以便进一步分离鉴定。对于 有病症的样品，应该在浸泡后立即进行病菌分离试验。 7.3模板DNA提取 收集具有7.2中典型特征的菌落，按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA，所 提取的模板DNA溶于50μLTE中。剩余菌保存在4℃条件下，以备确证试验使用。 DNA提取和纯化过程应设置核酸提取空白对照。 2 SN/T3756—2013 7.4DNA质量检测 将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭(或等效染料)的琼脂糖凝胶进行检测。然后用核酸/蛋白分析仪 分别在260nm和280nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD260/OD280≤2.0。 7.5PCR扩增 7.5.1 引物序列 引物序列及扩增片段长度见表1。 表1 引物序列及扩增片段长度 PCR扩增 引物来源 引物序列（5"-3"） 扩增片段大小 5'-GCG AAC TTGGCA GAG AT-3" 常规PCR 16S-23S 920 bp 5'-GCG CTT GCGTGT TAT GAG-3' 7.5.2 反应体系 反应体系见表2。 表2 2PCR反应体系 试剂名称 PCR反应体系 10×PCR缓冲液（含Mg+） 2.5 μL dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL TaqDNA聚合酶(5U/μL) 0.5 μL 正向引物和反向引物（25pmol/μL） 各1.0μL DNA模板（50ng~200ng） 3.0 μL 双燕水 补至25μL 注1：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。 注2：每个反应体系应设置两个平行反应。 7.5.3 反应条件 94℃预变性1min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，进行25个循环；72℃延伸 5min。使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。 7.5.4阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 阴性对照：非玉米细菌性枯萎菱病菌DNA为模板。 阳性对照：已知玉米细菌性枯萎病菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板。 空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以H2O代替样品）；二是PCR反应的 空白对照（以水代替DNA模板）。 3 SN/T 3756—2013 7.5.5PCR扩增产物的电泳检测 为0.5μg/mL，也可在电泳后进行染色）。取5μLPCR扩增产物，和1μL上样缓冲液混合，进行点样， 用DNA分子量标记物做参照。1.5V/cm恒压电泳，电泳30min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统 记录并保存。 8结果判定和报告 8.1对照结果 阳性对照：出现920bp的扩增条带。 阴性对照：未出现特征条带。 空白对照：未出现特征条带。 8.2检测结果 8.2.1对照实验结果正常，待测样品未出现920bp扩增条带，则可判定该样品结果为阴性，报告未检出 玉米细菌性枯萎病菌。 8.2.2对照实验结果正常，待测样品出现920bp扩增条带，则可初步判定该样品结果为阳性，可依据 SN/T1375对该病菌进行进一步确认，最终结果以后者的检疫结果为准，报告检出（或未检出）玉米细 菌性枯萎病菌。 8.2.3对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。 9样品的保存 保存样品应不少于1kg，船运做装玉米样品的保存应按舱别、层次、品种、等级分别存放；种用玉米 样品的保存按批号或品种分别存放。保存样品绎登记和经手人签字后置于低温干燥、防虫防鼠处妥善 保存2个月。检出玉米细菌性枯病菌的样品垒少要保存6个有，已备复验、谈判和仲裁。保存期满 后，需经灭菌处理。 SN/T3756—2013 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 改良W氏培养基 A.1 A.1.1成分 燕糖（C12H22O.） 10 g 5g 蛋白陈 0.5 g 磷酸氢二钾（KzHPO,） 0.25 g 硫酸镁（MgSO·7H2O) 琼脂 18 g 抗坏血酸 蒸馏水 1000.0mL A.1.2制法 将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.2~7.4.120℃高压灭莆20min。 A.20.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2) A.2.1成分 氯化钠(NaCI) 8g 氯化钾(KCI) 0.2 g 1.44g 磷酸氢二钠（NazHPO4） 磷酸二氢钾（KH,PO,） 0.24 g 蒸馏水 800.0mL A.2.2