SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3895—2014 转基因亚麻籽FP967品系实时荧光 PCR检测方法 Real-time fluorescence PCR method for detection of genetically modified componentsintriffidflax(EventFP967) 2014-01-13发布 2014-08-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3895—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参考了EU-CRL的"NOST-Spec construct-specific methodforthe detectionof CDCtriffid flax（EventFP967）usingreal-timePCR”方法 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：曹际娟、张莹、王金玲、徐君怡、贾金生。 I SN/T3895—2014 转基因亚麻籽FP967品系实时荧光 PCR检测方法 范围 本标准规定了转基因亚麻籽FP967品系（又称作CDCTriffid)检测的实时荧光PCR方法。 本标准适用于转基因亚麻籽FP967品系（又称作CDCTriffid)的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T19495.3车 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 术语、定义和缩略语 3 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 转基因transgene 将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导人手段，使其在该物种中进 行表达，以便该物种获得新的品种特征， 3.1.2 内源基因endogenousgene 在栽培的物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于对基因组中某一目的 基因的分析。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：CCycle，t：threshold，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。 dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸。 EDTA：ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。 NOST-Spec：NOSterminatorandspectinomycinresistancegene，NOS终止子-奇放线菌素抗性基 因。奇放线菌素抗性基因是FP967品系转基因亚麻籽独有基因，目前未在其他任何转基因作物中 使用。 PCR：polymerasechainreaction，简称PCR。 SAD：stearoyl-acylcarrierproteindesaturase，硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶。 Tris：tris（hydroxymethyl）aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。 1 SN/T38952014 TE：Tris-HCI、EDTA缓冲液。 Taq酶：DNA聚合酶。 UNG酶：uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)酶。 4 主要仪器 4.1 实时荧光定量PCR仪。 4.2 核酸蛋白分析仪。 4.3 微量进样器（0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)。 4.4 高速冷冻离心机。 4.5 纯水器或双蒸水器。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 5.1 实验用水：应符合GB/T6682中一级水规格。 5.2 PCR缓冲液。 5.3 氯化镁（MgCl2）。 5.4 dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP)。 5.5 UNG酶(Uracil N-glycosylase)。 5.6 Taq酶。 5.7 CTAB裂解液：3%CTAB（质量浓度），1.4mol/LNaCl，0.2%（体积分数）巯基乙醇，20mmol/LED TA,100 mmol/L Tris-HCl,pH8.0。 5.8 三氯甲烷。 戊醇。 5.9 5.10 丙醇。 5.11 70%乙醇。 5.12 TE:1mmol/LEDTA,1o mmol/LTris-HCl,pH8.0。 5.13 引物和探针。 FP967品系转基因亚麻籽成分实时荧光PCR检测所用引物和探针序列见表1。 表1 实时荧光PCR实验所用引物和探针序列 探针序列 基因或品系名称 引物序列 5'标记FAM；3'标记TAMRA或Eclipse SAD 5'-GCT CAA CCC AGT CAC CAC CT-3' 6-FAM-5'-TGT TGA GGG AGC GTG TTG （内源基因） 5'-TGC GAG GAG ATC TGG AGG AG-3' AAG GGA-3'-BHQ NOST-Spec 5'-AGC GCGCAA ACT AGG ATA AA-3 6-FAM-5'-CGC GCG CGG TGT CAT CTA （外源基因/品系鉴定） 5'-ACC TTC CGG CTC GAT GTC TA-3' TG-3'-BHQ 6 检测步骤 6.1 制样 称取约50g亚麻籽样品，经干热灭菌（150℃干热预处理2h)或120℃、30min高压消毒处理的碾 2 SN/T3895—2014 钵或粉碎机中碾磨至样品粉末颗粒约0.5mm左右大小。 6.2模板DNA提取 称取500mg粉样于10mL离心管中，加人5mLCTAB裂解液（含适量RNA酶），混匀，60℃水浴 振荡保温1h;2000r/min离心5min；取上清液，加等体积氯仿/异戊醇（体积比：24/1）混匀，静置 5min，8000r/min离心5min;小心取离心上清液，再加等体积氯仿/异戊醇（体积比：24/1)混匀，静置 5min，8000r/min离心5min；取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇，混匀，12000r/min4℃离心 10.min；弃上清液，加500μL70%冰乙醇洗涤一次，12000r/min4℃离心5min；弃上清，将沉淀晾干， 加人50μLTE，溶解沉淀（4℃过夜，或37℃保温1h）；此即为总DNA提取液。 也可用相应市售DNA提取试剂盒提取样品DNA，或按照GB/T19495.3执行。 6.3DNA浓度和纯度的测定 取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm 和280nm处的吸收值。DNA的浓度按照式（1)计算。 C=A260XNX50 (1) 式中： -DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； C A260——260nm处的吸光值； N—核酸稀释倍数。 当浓度为10μg/mL～100μg/mL，A260/A28比值在1.7～1.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。 6.4对照设置 检测过程中应按照GB/T19495.2中的规定设置对照。 阴性目标DNA对照：不含外源目标核酸序列的DNA片段。 阳性目标DNA对照：参照DNA、或从可溯源的标准物质提取的DNA、或从含有已知序列阳性样 品（或生物）中提取的DNA。 扩增试剂对照：该对照包括除了测试样品模板DNA以外所有的反应试剂，在PCR反应体系中用 相同体积的水(不含核酸）取代模板DNA。 6.5实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系见表2、表3（可根据实际需要任选其一），每个样品各做两个平行管。加样 时应使样品DNA溶液完全落入反应液中，不要粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。 表2实时荧光PCR反应体系（1） 试剂名称 终浓度 μL 10×PCR反应缓冲液 1x 5 MgCl2(25 mmol/L) 2.5 mmol/L 5 dNTP(10 mmol/L) 200 nmol/L 1 UNG酶(1U/μL) 0.5 U 0.5 上游引物（10μmol/L) 200 nmol/L 1 下游引物(10μmol/L) 200 nmol/L 1 3 SN/T3895—2014 表2（续） 试剂名称 终浓度 μL 探针（5μmol/L) 100 nmol/L 1 Taq酶(5U/μL) 2.5 U 0.5 DNA模板（40ng/μL~50ng/μL) 5 补水至 50 注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量；也可根据具体情况或不同的反应 总体积进行适当调整。 表3 实时荧光PCR反应体系（2） 试剂名称 终浓度 μL TaqMan?Universal PCRMaster Mix (2×) 1x 12.5 上游引物（10μmol/L） 800 nmol/L 1.00 下游引物（10μmol/L) 800 nmol/L 1.00 0.125 探针（5μmol/L) 100 nmol/L DNA模板（40ng/μL~50ng/μL) 4.0 补水至 25 注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量；也可根据具体情况或不同的反应 总体积进行适当调整。 6.6 实时荧光PCR反应参数 实时荧光PCR的反应参数为：50℃PCR前去污染2min；预变性95℃10min;95