SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3903—2014 进境牛、羊包虫病检疫技术规范 Quarantineprotocolfor echinococcosis of entry cattle,sheep and goats 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标 示准 进境牛、羊包虫病检疫技术规范 SN/T 3903--2014 * 中国标准出版社出版 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029) 北京市西城区三里河北街16号（100045） 总编室：（010)68533533 网址www.spc.net.cn 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本880×12301/16印张1字数24千字 2014年12月第一版 反2014年12月第一次印刷 印数1--1300 * 书号：155066·2-27859 定价18.00元 SN/T 3903—2014 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准修改采用国际动物卫生组织（OIE）编写的《陆生动物疾病诊断手册》（2010版）中2.01.04 Echinococcosis/Hydatidosis中牛羊包虫病部分的有关内容制定而成。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、青海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴绍强、王彩霞、赵青、林祥梅、刘建、邓俊花 SN/T3903—2014 进境牛、羊包虫病检疫技术规范 1范围 本标准规定了进境牛、羊包虫病检疫时的形态学鉴定、组织病理学鉴定、ELISA检测以及PCR检 测的技术规范。 本标准适用于进境牛、羊等动物及其产品中包虫（即细粒棘球坳）的检疫 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1193 基因检验实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 过碘酸希夫反应 periodic-acid-Schiffreaction;PAS 糖被强氧化剂过碘酸氧化后，形成多醛。多醛再与无色的品红硫酸复合物（即希夫试剂)结合，形成 紫红色产物。在结缔组织中出现PAS阳性的无细胞堆积层即为棘球蝴。 临床诊断 牛羊在轻度感染及感染初期通常无明显症状，严重感染时表现被毛逆立，消瘦，发育不良。寄生肺 部时有明显咳嗽，寄生在肝脏可引起消化不良等症状。但一般临床症状不明显。 5 实验室检测 5.1 组织病理学鉴定 5.1.1剖检 细粒棘球蜘主要寄生于牛或羊的肝、肺等部位，用手触诊或者剖开组织时可发现包囊。如在囊内或 育囊中发现原头节即可确诊为棘球坳。如结构不清，可进一步采用过碘酸希夫反应（PAS)进行确诊。 5.1.2形态学检查 细粒棘球坳为包囊状构造，直径5cm～10cm，最大可达30cm，囊内充满淡黄色液体，可生成内源 性子囊以及原头蜘。原头蝴顶突上有两排小钩，钩的大小不同，第一排长22μm～45μm，第二排长 18μm~38μm（参见附录A）。 检获的可疑包囊组织用4%甲醛固定，并采用过碘酸希夫反应进行确诊。 1 SN/T3903—2014 5.1.3 3过碘酸希夫反应（PAS) 5.1.3.1 主要试剂与设备 5.1.3.1.1 高碘酸溶液：配制方法见附录B中B.1。 5.1.3.1.2 1%淀粉糖化酶溶液：配制方法见B.1。 5.1.3.1.3 Schiff溶液：配制方法见B.1。 5.1.3.1.4 亚硫酸氢盐溶液：配制方法见B.1。 5.1.3.1.5 Harris苏木素染液：配制方法见B.1。 5.1.3.1.6 切片机。 5.1.3.1.7 光学显微镜。 5.1.3.2 试验步骤 5.1.3.2.1 切取经过4%甲醛固定的可疑包囊1cm~3cm，用水冲洗后，用浓度分别为35%、50%、 70%、85%、95%、100%的梯度乙醇逐步脱水，根据包囊的大小调整每一步所需的时间（1h～3h），每一 步至少1h，100%乙醇需要两次。 5.1.3.2.2 经50%无水乙醇十50%二甲苯至少30min后，再用二甲苯透明两次，每次至少30min。 5.1.3.2.3 5.1.3.2.4 用石蜡包埋，切片，切片厚度约4um～6um，用粘片剂固定于洁净的载玻片上烘干。 5.1.3.2.5 用二甲苯脱蜡10min，再用50%无水乙醇十50%二甲苯浸泡5min，然后用浓度分别为 100%、95%、85%、70%、50%、35%的梯度乙醇逐步复水。每步约3min5min，最后置蒸馏水中。 5.1.3.2.6试验应设立肝、肺等未感染正常组织对照：待检组织切片用高碘酸溶液处理2min5min， 用蒸馏水充分漂洗；正常组织切片则用1%淀粉糖化酶37℃消化1h，再用蒸馏水漂洗。 5.1.3.2.7 室温，Schiff试剂作用15min。 5.1.3.2.8 用亚硫酸氢盐溶液浸/3次每次2min。然后流水冲5min，再用蒸馏水漂洗1min。 5.1.3.2.9 用Harris苏木素染液复染10-min15min，然后流水冲5min，再用蒸馏水漂洗1min。 5.1.3.2.10 用浓度分别为70%、85%95%、100%的梯度乙醇逐步脱水，再按5.1.3.2.2透明，每步约 5min~10min。 5.1.3.2.11 用中性树脂封片。 5.1.3.3 结果判断 用光学显微镜观察，当待检组织的胚芽层膜的非细胞堆积层呈紫红色，即PAS阳性反应，经消化的 对照组织切片相应部位为PAS阴性反应，即可判定为棘球坳感染。 5.2酶联免疫吸附试验（ELISA)检测 5.2.13 主要试剂与设备 5.2.1.1 包被液：磷酸盐缓冲液，配制方法见B.2。 5.2.1.2洗涤液：0.01mol/LPBST，配制方法见B.2。 5.2.1.3稀释液：含1%的牛血清白蛋白（BSA），配制方法见B.2。 5.2.1.4封闭液：含1%BSA，配制方法见B.2。 5.2.1.5底物溶液：0.05mol/LpH5.0磷酸-柠檬酸，配制方法见B.2。 5.2.1.6 TMB使用液：配制方法见B.2。 5.2.1.7 终止液：配制方法见B.2。 2 SN/T3903-—2014 5.2.1.8标准抗原和阴阳性血清：牛、羊细粒棘球坳阳性抗原以及阳性血清、阴性血清，其制备过程见附 录C。 5.2.1.10酶标仪。 5.2.2试验步骤 5.2.2.1以包被液稀释包虫标准抗原至2.5μg/mL，每孔100μL包被96孔ELISA板，4℃过夜。 5.2.2.2去除包被液，用300μLPBST洗涤5次，每次洗涤10min，拍干。每孔加人300μL封闭液，室 温孵育1h。 5.2.2.3弃掉封闭液，300μLPBST洗涤5次，每次洗涤10min，拍干。每孔加人100μL用稀释液 1：10稀释的受检牛（羊）血清（受检血清的制备方法见附录C），同时设阳性对照和阴性对照以及复孔 （即每个样品设置两个孔），室温孵前1h。 5.2.2.4用300μLPBST洗涤5次，每次10min，拍干。每孔加人100μL用稀释液以1：2000稀释过 的辣根过氧化物酶标兔抗牛（羊）IgG多克隆抗体，室温孵育1h。 5.2.2.5用PBST洗涤5次，每次洗涤10min，拍干。每孔加人100μLTMB，室温避光孵育15min。 5.2.2.6每孔加人100μL1mol/L的HzSO，终止显色反应，如果是阳性，颜色由蓝色变为黄色， 10min内在490nm波长下读取每孔的吸光值。 5.2.3 结果判定 5.2.3.1实验成立判定 阴性与阳性的临界阈值为标准阴性孔平均OD值士3S（s计算方法见附录D)，当标准阳性血清大 于标准阴性孔平均OD值+3s时，判定试验成立；否则试验无效，应分析试验失败原因，并重新试验。 5.2.3.2结果判定 样品OD值大于标准阴性孔平均OD值+Bs时为阳性；小于标准阴性孔平均OD值－3s时为 阴性。 当样品OD值介于（标准阴性孔平均OD值一3s）和（标准阴性孔平均OD值十3s）为可疑，可疑样 品应重检一次，重检后的OD值大于标准阴性孔平均OD值千3s判为阳性，小于标准阴性孔平均OD 值一3s判为阴性；重检仍为可疑者判为阳性。 对于ELISA检测阳性动物，应结合剖检进行形态学鉴定或者PAS反应或者采样进行PCR才能 确诊。 5.3聚合酶链式反应(PCR)检测 5.3.1主要试剂与设备 5.3.1.1DNA抽提所需要的相关试剂见附录E。 5.3.1.2引物： a）针对羊源细粒棘球蝴线粒体基因12srRNA： Eg1f:5'-CATTAATGTATTTTGTAAAGTTG-3 Eg1r:5'-CACATCATCTTACAATAACACC-3" 预期片段长度为255bp（参见附录F中F.1)。 b）针对细粒棘球坳基因组重复序列： Eg1121a:5'-GAATGCAAGCAGCAGATG-3 3