SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3970—2014 出口食品中白色念珠菌检测方法 Determination of candida albicans in foods for export 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3970—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：段效辉、许红岩、刘宁、祝素珍、李兆杰、刘金华、曹鹏、鲁闽、王颖。 1 SN/T3970—2014 出口食品中白色念珠菌检测方法 1范围 本标准规定了出口食品中白色念珠菌的检测方法。 本标准适用于出口食品中白色念珠菌的定性检测。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1538.1培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T1538.2培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 白色念珠菌 Candidaalbicans 又名白假丝酵母，有酵母相和菌丝相的双相型真菌，能形成芽管、厚膜孢子，参见附录B。 3.2 芽管germtube 细胞发芽时伸展出的无隔壁的管状构造。 3.3 厚膜孢子 clamydospore 营养细胞原来的壁变厚且贮有丰富物质所形成的休眠期的孢子，由菌丝内胞浆浓缩和胞壁增厚 形成。 设备和材料 4.1 高压灭菌锅。 4.2 均质器。 4.3 生物安全柜：生物安全Ⅱ级。 4.4 恒温培养箱：25℃±1℃、32.5℃±2.5℃、37℃±1℃。 4.5 显微镜。 4.6 天平：精度0.1g。 4.7 无菌移液管：10mL（具0.1mL刻度）。 4.8 无菌平皿：直径90mm（或其他商业用一次性无菌平皿）。 4.9 镊子。 4.10 接种环。 SN/T3970—2014 4.11 剪刀。 4.12 载玻片。 4.13 盖玻片。 4.14 酒精灯。 4.15 均质袋或均质瓶。 培养基和试剂 5 除另有规定外，水为双蒸水。 5.1 液体沙氏培养基：见A.2。 5.2 TTC（2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride）沙氏琼脂培养基：见A.3。 5.3 1%的吐温80玉米培养基：见A.4。 5.4 牛或马血清。 5.5 革兰氏染色试剂：见A.5。 5.6 念珠菌显色培养基：见A.6。 6 检验程序 白色念珠菌检验程序见图1 25g(mL)+22 mL液体沙氏培 32.5℃ 2.5℃48 TTC沙氏琼脂 念珠菌显色培养基 32.5C±25℃48 芽管形成试验厚膜孢子 结果报告 图1 白色念珠菌检验程序图 1 检测步骤 7.1增菌培养 无菌操作取检样25g（mL），加人装有225mL液体沙氏培养基的无菌均质袋或均质瓶中。固体样 2 SN/T39702014 品应以均质器8000r/min～10000r/min打碎或以剪刀充分剪碎，于32.5℃土2.5℃恒温培养箱内培 养48h士2h，必要时延长至72h。 7.2分离培养 以直径3mm~5mm接种环挑取增菌液一环划线接种于TTC沙氏琼脂培养基平板和白色念珠菌 显色培养基平板，32.5℃土2.5℃培养48h士2h。在TTC沙氏琼脂培养基平板上，典型的白色念珠 菌呈白色，表面光滑。白色念珠菌菌落在念珠菌显色培养基上特征按照显色培养基说明进行判断。 7.3鉴定 7.3.1革兰氏染色 挑取可疑菌落涂片，进行革兰 氏染色。显微镜下观察，白色念珠菌呈革兰氏阳性，细胞呈圆形或卵 圆形，有时有芽生细胞。 7.3.2芽管形成试验 取TTC沙氏琼脂培养基平板上可疑菌落接种于0.5 mL~1.0mL牛或马血清中，37℃±1℃，放 置1.5h~3.0h。取上述牛或马血清- 滴于载玻片 上，盖上盖玻片，在显微镜下观察是否有芽管形成。 典型的白色念珠菌可观察到由孢子长出的圆柱形的丝状芽管。 7.3.3厚膜孢子形成试验 以无菌接种环取可疑菌落划线接种于1%吐温80玉米培养基表面，并盖上无菌盖玻片，25℃培养 24h～48h后，取上述培养后的盖玻片置于无菌载玻片上，在显微镜下观察是否有厚膜孢子形成。典型 的白色念珠菌可观察到膨大的厚膜孢子 8 结果报告 8.1若可疑菌落符合7.3.1~7.3.3的要求，报告结果：白色念珠菌检出/25g（mL）； 8.2若可疑菌落不符合7.3.1~7.3.3的要求，报告结果：白色念珠菌 未检出/25g（mL）。 9 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，收集后进行高压火菌或焚烧 3 SN/T3970—2014 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 一般要求 为保证培养基的质量，宜按照SN/T1538.1和SN/T1538.2对培养基进行质量控制 A.2 液体沙氏培养基 A.2.1 成分 蛋白陈 10 g 葡萄糖 40g 蒸馏水 1000mL A.2.2 2制法 用700mL蒸馏水将琼脂溶解，300mL蒸馏水将葡萄糖与蛋白陈溶解，混合上述两部分，摇匀后分 装，115℃灭菌15min。 A.3 TTC（2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride）沙氏琼脂培养基 A.3.1 沙氏琼脂 A.3.1.1 成分 蛋白陈 10 g 葡萄糖 40g 琼脂 20 g 蒸馏水 1000mL A.3.1.2 制法 称取各成分，加人1000mL蒸馏水，加热溶解后分装，115℃灭菌15min，备用。使用前，用过 滤除菌方法加人0.05g/L的氯霉素。 A.3.1.3 TTC(23,5,triphenyltetrazoliumchloride) A.3.1.4 成分 TTC 0.5g 蒸馏水 100 mL A.3.1.5 制法 溶解后过滤，121℃灭菌20min，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用。 4 SN/T3970—2014 A.3.20.5%TTC的沙氏琼脂培养基 按1mL0.5%TTC溶液：100mL沙氏琼脂培养基比例向熔化的沙氏琼脂中添加TTC溶液，充 分振荡混匀，倾注平板备用。 A.41%吐温80玉米培养基 A.4.1成分 7g 玉米浸粉 琼脂 15 g 吐温80 10 g 蒸馏水 1000mL A.4.2 制法 称取各成分，加人1000mL蒸馏水，加热溶解后分装，121℃高压灭菌15min，备用。 A.5 革兰氏染色液 A.5.1结晶紫染色液 A.5.1.1成分 结晶紫 1.0 g 95%乙醇 20.0mL 1%草酸铵水溶液 80.0mL A.5.1.2制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.5.2 革兰氏碘液 A.5.2.1 成分 1.0 g 碘 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300mL A.5.2.2制法 将碘与碘化钾先行混合，加人蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。 A.5.3 沙黄复染液 A.5.3.1成分 沙黄 0.25g 95%乙醇 10.0mL 蒸馏水 90.0mL 5